יצירת פרופיל של שינוי H3K4me3 בצמחים באמצעות מחשוף תחת מטרות ותגיות
Summary
מחשוף תחת מטרות ותגיות (CUT&Tag) היא אסטרטגיית פרופיל אפיגנומית כרומטין יעילה. פרוטוקול זה מציג אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת ליצירת פרופיל של שינויים בהיסטון בצמחים.
Abstract
רגולציה אפיגנומית ברמה הכרומטית, כולל שינויי DNA והיסטון, התנהגויות של גורמי שעתוק, ו- RNAs שאינם מקודדים עם החלבונים המגויסים שלהם, מובילים לשליטה זמנית ומרחבית בביטוי הגנים. מחשוף תחת מטרות ותגית (CUT&Tag) היא שיטה לקשירת אנזימים שבה חלבון הכרומטין הספציפי מזוהה תחילה על ידי הנוגדן הספציפי שלו, ולאחר מכן הנוגדנים קושרים חלבון A-transposase (pA-Tn5) חלבון היתוך חלבון, אשר מבקע את הכרומטין הממוקד במקום על ידי הפעלת יוני מגנזיום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול CUT&Tag שפורסם בעבר שלנו באמצעות גרעינים שלמים מבודדים מעלי כותנה allortetraploid עם שינוי. פרוטוקול שלב אחר שלב זה יכול לשמש למחקר אפיגנומי בצמחים. בנוסף, שינויים משמעותיים בבידוד גרעיני הצמח מסופקים עם הערות קריטיות.
Introduction
גורם שעתוק מחייב אתרי DNA וכרום פתוח הקשורים לסימני שינוי היסטון משרתים תפקידים פונקציונליים קריטיים בוויסות ביטוי הגנים והם המוקדים העיקריים של מחקר אפיגנטי1. באופן קונבנציונלי, בדיקת אימונופרציפציה כרומטין (ChIP) יחד עם ריצוף עמוק (ChIP-seq) שימשו לזיהוי רחב הגנום של שינוי היסטון כרומטין ספציפי או מטרות DNA עם חלבונים ספציפיים, והוא מאומץ באופן נרחב בתחום האפיגנטיקה2. מחשוף תחת מטרות וטכנולוגיית תיוג (CUT&Tag) פותחה במקור על ידי מעבדת Henikoff כדי ללכוד את שברי ה- DNA הקשורים לחלבון ברחבי הגנום5. בהשוואה ל- ChIP, CUT&Tagcan מייצרים ספריות DNA ברזולוציה גבוהה וברקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט3. עד כה, שיטות לניתוח של אזורי כרומטין עם שינויים histone ספציפיים באמצעות CUT&Tag הוקמו בתאי בעלי חיים4,5. באופן ספציפי, CUT&Tag חד-תאי (scCUT&Tag) פותח בהצלחה גם עבור רקמות ותאים אנושיים6. עם זאת, בשל המורכבות של דופן התא ומטבוליטים משניים, CUT&Tag עדיין מאתגר מבחינה טכנית עבור רקמות צמחים.
בעבר, דיווחנו על פרוטוקול CUT&Tag באמצעות גרעינים שלמים מבודדים מעלי כותנה allotetraploid4. כדי להדגים את היעילות של בידוד גרעינים ולכידת DNA באמצעות רקמת צמח, הליך הפרופיל מוצג כאן. הצעדים העיקריים כוללים בידוד גרעינים שלם, בדגרה במקום עם הנוגדן לשינוי כרומטין, דגירה של טרנספוזאז, שילוב מתאם והכנת ספריית DNA. פתרון הבעיות מתמקד בהכנת ספריית CUT&Tag לבידוד גרעיני הצמח ובקרת האיכות.
במחקר זה, אנו מציגים אסטרטגיית CUT&Tag מעודנת לצמחים. לא רק שאנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב עבור פרופיל H3K4me3 בעלי כותנה, אלא שאנו מספקים גם מתודולוגיה ממוטבת לבידוד גרעינים צמחיים, כולל האסטרטגיה לבחירת ריכוז חומר הניקוי לליזה נכונה של התאים והאסטרטגיה לסנן את הגרעינים. שלבים מפורטים עם הערות קריטיות כלולים גם בפרוטוקול מעודכן זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, תיארנו את CUT&Tag, טכנולוגיה ליצירת ספריות DNA ברזולוציה גבוהה ורקע נמוך במיוחד באמצעות מספר קטן של תאים עם הליך פשוט יותר בהשוואה לאימונופרציפציה כרומטין (ChIP). ההצלחה שלנו עם פרופיל H3K4me3 בעלי כותנה מצביעה על כך ש- CUT&Tag, שתוכננה לראשונה לתאי בעלי חיים, יכולה לשמש גם לתאי צמחים. הן מערכת החיץ Tr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה כלכלית בחלקה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC, 31900395, 31971985, 31901430), וקרנות מחקר בסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות, מעבדת הזרעים של מפרץ היינאן יאזו (JBGS, B21HJ0403), הקרן למדעי הטבע המחוזית של היינאן בסין (320LH002) ופרויקט JCIC-MCP.
Materials
| Antibody | |||
| Anti-H3K4me3 | Millipore | 07-473 | |
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | |
| Chemicals | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Make 10 mg/ml BSA stock solution. Store at -20°C | ||
| digitonin (~50% (TLC) | Sigma-Aldrich | D141 | Make 5% digitonin stock solution (200 mg digitonin [~50% purity] to 2 mL DMSO). Note: Sterilize using a 0.22- micron filter. Store at -20°C |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | |||
| chloroform | |||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Make 0.5 M EDTA (pH = 8.5) stock solution. Note: Making 100 mL of 0.5-M EDTA (pH = 8.5) requires approximately 2 g of sodium hydroxide (NaOH) pellets to adjust the pH | ||
| ethanol | |||
| GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL) | Invitrogen | AM9516 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Make 1 M MgCl2 stock solution | ||
| protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539133-1SET | |
| potassium chloride (KCl) | Make 1 M KCl stock solution | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1,v:v:v) | |||
| sodium chloride (NaCl) | Make 5 M NaCl stock solution | ||
| spermidine | Make 2 M spermidine stock solution, store at -20°C. | ||
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Make 10% SDS stock solution. Note: Do not autoclave; sterilize using a 0.22-micron filter | ||
| Tris base | Make 1 M Tris (pH = 8.0) stock solution | ||
| Triton X-100 | Make 20% Triton X-100 stock solution | ||
| Enzyme | |||
| Hyperactive pG-Tn5/pA-Tn5 transposase for CUT&Tag | Vazyme | S602/S603 | Check the antibody affinity of the protein A or protein G that is fused with the Tn5. Generally speaking, proteins A and G have broad antibody affinity. However, protein A has a relatively higher affinity to rabbit antibodies and protein G has a relatively higher affinity to mouse antibodies. Select the appropriate transposase products that match your antibody. |
| TruePrep Amplify Enzyme | Vazyme | TD601 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| PCR machine | Applied Biosystems | ABI9700 | |
| Orbital shaker | MIULAB | HS-25 | |
| NanoDrop One spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-ONE-W |
Riferimenti
- Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120 (2020).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
- Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
- Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
- Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11 (2007).
- Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679 (2021).
- Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time – How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).
