Profilazione della modifica H3K4me3 negli impianti utilizzando la scissione sotto target e tagmentazione

Summary

La scissione sotto bersagli e tagmentazione (CUT&Tag) è un'efficiente strategia di profilazione epigenomica della cromatina. Questo protocollo presenta una raffinata strategia CUT&Tag per la profilazione delle modificazioni istoniche negli impianti.

Abstract

La regolazione epigenomica a livello cromatico, comprese le modificazioni del DNA e degli istoni, i comportamenti dei fattori di trascrizione e gli RNA non codificanti con le loro proteine reclutate, portano al controllo temporale e spaziale dell'espressione genica. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&Tag) è un metodo di legame enzimatico in cui la proteina cromatina specifica viene prima riconosciuta dal suo anticorpo specifico, e quindi l'anticorpo lega una proteina di fusione A-transposasi (pA-Tn5), che scinde la cromatina mirata in situ dall'attivazione degli ioni magnesio. Qui, forniamo il nostro protocollo CUT&Tag precedentemente pubblicato utilizzando nuclei intatti isolati da foglie di cotone allortetraploid con modifica. Questo protocollo passo-passo può essere utilizzato per la ricerca epigenomica nelle piante. Inoltre, le modifiche sostanziali per l'isolamento dei nuclei vegetali sono fornite con commenti critici.

Introduction

I siti del DNA legante il fattore di trascrizione e la cromatina aperta associata ai segni di modificazione degli istoni svolgono ruoli funzionali critici nella regolazione dell'espressione genica e sono i principali obiettivi della ricerca ^epigenetica1. Convenzionalmente, il saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) accoppiato con il sequenziamento profondo (ChIP-seq) è stato utilizzato per l'identificazione a livello di genoma di specifici bersagli dell'istone della cromatina o del DNA con proteine specifiche ed è ampiamente adottato nel campo dell'epigenetica2. La tecnologia CUT&Tag (Cleavage under targets....

Protocol

1. Preparare la trasposasi e le soluzioni stock (Giorno 1)

NOTA: In questa parte, gli adattatori oligonucleotidici sono complessati con trasposasi Tn5 per rendere attiva la transposasi.

1. Primer diluiti (primer A, primer B e primer C) a 100 μM di concentrazione utilizzando il tampone di ricottura (10 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) (fare riferimento alla Tabella 1 per le informazioni sulla sequenza dei primer e alla Tabella 2 per le ricette per le soluzioni di lavoro). Conservare a -20 °C fino all'uso.
2. Impostare le seguenti due reazioni in tubi PCR: Reazione 1 (adat....

Results

Nella Figura 1 viene illustrato il flusso di lavoro CUT&Tag. La Figura 2 mostra la colorazione DAPI dei nuclei intatti. L'obiettivo della fase di "isolamento dei nuclei" era quello di ottenere i nuclei intatti in una quantità sufficiente per la successiva reazione CUT&Tag. La Figura 3 mostra l'elettroforesi su gel di agarosio dei prodotti PCR. Il controllo negativo IgG è richiesto in parallelo durante la configurazione dell'.......

Discussion

Qui abbiamo descritto CUT&Tag, una tecnologia per la generazione di librerie di DNA ad alta risoluzione e background eccezionalmente basso utilizzando un piccolo numero di cellule con una procedura semplificata rispetto all'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Il nostro successo con la profilatura H3K4me3 nelle foglie di cotone suggerisce che CUT&Tag, che è stato inizialmente progettato per le cellule animali, può essere utilizzato anche per le cellule vegetali. Sia il sistema tampone Tris comunemente usato per i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
IgG normali di coniglio	Millipore	12-370
Chemicals
Bovine Serum Albumin (BSA)			Make 10 mg/ml di soluzione madre BSA. Negozio a -20 gradi C
digitonina (~50% (TLC)	Sigma-Aldrich	D141	Preparare una soluzione madre al 5% di digitonina (200 mg di digitonina [~50% di purezza] in 2 mL di DMSO). NOTA: Sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 micron. Negozio a -20 gradi C
dimetilsolfossido (DMSO)cloroformio
acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)Produrre			0,5 M EDTA (pH = 8,5) soluzione madre. Nota: la produzione di 100 mL di EDTA 0,5-M (pH = 8,5) richiede circa 2 g di pellet di idrossido di sodio (NaOH) per regolare il pH
etanolo
Coprecipitante GlycoBlue (15 mg/mL)	Invitrogen	AM9516
cloruro di magnesio (MgCl2)Make			1 M MgCl2 cocktail di
inibitori della proteasi	Calbiochem	539133-1SET
cloruro di potassio (KCl)			Produrre 1 M KCl soluzione madre
fenolo:cloroformio:alcol isoamilico (25:24:1,v:v:v
cloruro di sodio (NaCl)			Produrre 5 M NaCl soluzione madre
spermidina			Produrre 2 M soluzione madre di spermidina, conservare a -20°C.
sodio dodecil solfato (SDS)			Produce una soluzione madre SDS al 10%. NOTA: Non sterilizzare in autoclave; sterilizzare utilizzando un filtro da 0,22 micron
Tris			Produrre 1 M Soluzione madre Tris (pH = 8,0)
Triton X-100			Produrre il 20% Soluzione madre Triton X-100
Enzima
Iperattivo pG-Tn5/pA-Tn5 trasposasi per CUT& Tag	Vazyme	S602/S603	Controllare l'affinità anticorpale della proteina A o della proteina G che è fusa con il Tn5. In generale, le proteine A e G hanno un'ampia affinità anticorpale. Tuttavia, la proteina A ha un'affinità relativamente più alta con gli anticorpi di coniglio e la proteina G ha un'affinità relativamente più alta con gli anticorpi di topo. Seleziona i prodotti di trasposasi appropriati che corrispondono al tuo anticorpo.
TruePrep Amplifica l'enzima	Vazyme	TD601
Equipment
Centrifuga	Eppendorf	5424R
Macchina PCR	Applied Biosystems	ABI9700
Agitatore orbitale	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  spettrofotometro	Thermo Scientific	ND-ONE-W