מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג’ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.
הגורם המוביל למוות ברחבי העולם נמשך כמו מחלות לב וכלי דם (CVD). עם זאת, דוגמנות המורכבות הפיזיולוגית והביולוגית של שריר הלב, שריר הלב, הוא ידוע לשמצה קשה להשיג במבחנה. בעיקר, מכשולים טמונים הצורך קרדיומיוציטים אנושיים (CMs) כי הם מבוגרים או להפגין פנוטיפים דמויי מבוגרים והוא יכול לשכפל בהצלחה את המורכבות התאית של שריר הלב וארכיטקטורה 3D מורכב. למרבה הצער, בשל חששות אתיים וחוסר זמין ראשוני נגזר רקמת לב אנושית, בשילוב עם התפשטות מינימלית של CMs, המקור של CMs אנושי קיימא כבר צעד מגביל עבור הנדסת רקמת לב. לשם כך, רוב המחקרים עברו לבידול לבבי של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (hiPSCs) כמקור העיקרי של CMs אנושיים, וכתוצאה מכך התאגדות רחבה של hiPSC-CMs בתוך מבחני חוץ למידול רקמת לב.
כאן בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול לפיתוח רקמת לב אנושית בוגרת תלת מימדית שמקורה בתאי גזע בתוך מכשיר מיקרופלואידי. אנו מסבירים באופן ספציפי ומדגימים ויזואלית את הייצור של מודל רקמת לב אניסוטרופית במבחנה במבחנה על שבב מ- CMs שמקורם ב- hiPSC. אנו מתארים בעיקר פרוטוקול טיהור לבחירה עבור CMs, תרבות משותפת של תאים עם יחס מוגדר באמצעות ערבוב CMs עם CFs אנושיים (hCFs), והשעיה של תרבות משותפת זו בתוך הידרוג’ל מבוסס קולגן. אנו מדגימים עוד יותר את ההזרקה של הידרוג’ל עמוס התאים בתוך המכשיר המיקרופלואידי המוגדר היטב שלנו, משובץ במיקרופוסטים אליפטיים מתנדנדים המשמשים כטופוגרפיה של פני השטח כדי לגרום ליישור גבוה של התאים שמסביב ומטריצת ההידרוגל, מחקה את הארכיטקטורה של שריר הלב המקומי. אנו צופים כי מודל הרקמה-על-שבב של הלב הדו-ממדי המוצע מתאים למחקרי ביולוגיה בסיסיים, דוגמנות מחלות, ובאמצעות השימוש בו ככלי סינון, בדיקות פרמצבטיות.
גישות הנדסת רקמות נחקרו בהרחבה, בשנים האחרונות, כדי ללוות ממצאים קליניים vivo ברפואה רגנרטיבית ומידול מחלות1,2. דגש משמעותי הושם במיוחד על מידול רקמת לב במבחנה בשל הקשיים הטבועים במיקור רקמת לב ראשונית אנושית והפקת תחליפים במבחנה רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, המגבילים את ההבנה הבסיסית של המנגנונים המורכבים של מחלות לב וכלי דם (CVDs)1,3. מודלים מסורתיים מעורבים לעתים קרובות 2D monolayer תרבות מבחנים. עם זאת, החשיבות של culturing תאי לב בתוך סביבה 3D לחקות הן את הנוף הטבעי של שריר הלב אינטראקציות הסלולר מורכב התאפיין בהרחבה4,5. בנוסף, רוב הדגמים שיוצרו עד כה כללו מונו-תרבות של CMs המובדלים מתאי גזע. עם זאת, הלב מורכב מסוגי תאים מרובים6 בתוך ארכיטקטורה 3D מורכב7, המצדיק את הצורך הקריטי לשפר את המורכבות של הרכב הרקמה בתוך מודלים 3D במבחנה כדי לחקות טוב יותר מרכיבים הסלולר של שריר הלב המקורי.
עד כה, גישות רבות ושונות נחקרו כדי לייצר מודלים ביומימטיים 3D של שריר הלב8. גישות אלה נעות בין הגדרות ניסיוניות המאפשרות חישוב בזמן אמת של כוח שנוצר, מן CMs מונו-תרבות זרע על סרטים דקים (נחשב סרטים דקים שרירים (MTFs))9, כדי co-culture תאי לב מטריצות הידרוג’ל 3D מושעה בין cantilevers העומדים חופשיים (נחשב רקמות לב מהונדסות (EHTs))10. גישות אחרות התמקדו ביישום טכניקות micromolding לחקות anisotropy שריר הלב, מן CMs מונו-תרבות הידרוג’ל 3D מושעה בין microposts בולטים במדבקת רקמה11, כדי מונו-תרבות CMs זרעים בין microgroovesמוסטים 12,13. ישנם יתרונות וחסרונות מובנים לכל אחת משיטות אלה, ולכן, זה רלוונטי לנצל את הטכניקה התואמת את היישום המיועד ואת השאלה הביולוגית המתאימה.
היכולת לשפר את ההבשלה של תאי גזע נגזר CMs חיוני להנדסת במבחנה מוצלחת של רקמת שריר הלב דמוי מבוגר ותרגום של ממצאים הבאים פרשנויות קליניות. למטרה זו, שיטות כדי בוגרת CMs נחקרו נרחב, הן 2D ו 3D14,15,16. לדוגמה, גירוי חשמלי המשולב ב- EHTs, יישור כפוי של CMs עם טופוגרפיה של פני השטח, רמזי איתות, גורמי גדילה מתרבות משותפת ו/או תנאי הידרוג’ל תלת-ממדיים וכו ‘, כולם מובילים לשינוי לטובת התבגרות CM לפחות באחת מהאפשרויות הבאות: מורפולוגיה של תאים, טיפול בסידן, מבנה סרקומרי, ביטוי גנים או כוח התכווצותי.
מבין מודלים אלה, הגישות המשתמשות בפלטפורמות מיקרופלואידיות שומרות על יתרונות מסוימים בטבע, כגון שליטה במעברי צבע, קלט תאים מוגבל וריאנטים מינימליים נחוצים. יתר על כן, משכפלים ביולוגיים רבים יכולים להיווצר בבת אחת באמצעות פלטפורמות microfluidic, המשרתים לנתח טוב יותר את המנגנון הביולוגי של עניין ולהגדיל את גודל המדגם הניסיוני לטובת כוח סטטיסטי17,18,19. בנוסף, שימוש בפוטוליטוגרפיה בתהליך ייצור המכשירים המיקרופלואידיים מאפשר יצירת תכונות מדויקות (למשל טופוגרפיות) ברמת המיקרו והננו, המשמשות כרמזים מזוסקופיים לשיפור המבנה התאי שמסביב וארכיטקטורת רקמות ברמת המאקרו18,20,21,22 עבור יישומים שונים בהתחדשות רקמות ומידול מחלות.
הדגמנו בעבר את הפיתוח של מודל חדש של רקמת לב תלת-ממדית על שבב המשלב טופוגרפיה של פני השטח, בצורה של מיקרופוסטים אליפטיים מולדים, כדי ליישר תאי לב מתורבתים הידרוג’ל-אנקפסולציה לתוך רקמה מחוברת, אניזוטרופית20. לאחר 14 ימים של תרבות, הרקמות שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי בוגרות יותר בפנוטיפ שלהם, פרופיל ביטוי גנים, מאפייני טיפול בסידן ותגובה פרמצבטית בהשוואה לבקרות איזוטרופיות חד שכבתיות ותלת-ממדיות23. הפרוטוקול המתואר בזאת מתאר את השיטה ליצירת רקמת לב אנושית מתורבתת תלת-ממדית זו , המיושרת (כלומר, אניזוטרופית) בתוך המכשיר המיקרופלואידי באמצעות CMs שמקורם ב- hiPSC. באופן ספציפי, אנו מסבירים את השיטות כדי להבדיל ולטהר hiPSCs כלפי CMs, תוספת של hCFs עם CMs כדי לייצר אוכלוסיית תרבות משותפת הוקמה, החדרת אוכלוסיית התא עטוף בתוך הידרוג’ל קולגן לתוך התקנים microfluidic, וניתוח הבא של רקמות 3D בנוי באמצעות מבחנים התכווצות immunofluorescent. מיקרו-רקמות מהונדסות תלת-ממד וכתוצאה מכך מתאימות ליישומים שונים, כולל מחקרי ביולוגיה בסיסיים, מידול CVD ובדיקות פרמצבטיות.
היווצרות מודל רקמת לב אנושי במבחנה עם אינטראקציות משופרות בין תאי התא ומבנה 3D ביומימטי הוא הכרחי למחקר לב וכלי דם בסיסי ויישומים קליניים מתאימים1. פרוטוקול מתואר זה מסביר את הפיתוח של רקמת לב אניזוטרופית אנושית תלת מימדית בתוך מכשיר מיקרופלואידי, תוך שימוש בתרבות משותפת…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות #1653193 פרס NSF CAREER, פרס ועדת המחקר הביו-רפואי של אריזונה (ABRC) (ADHS18-198872), ופרס קרן פלין על מתן מקורות מימון לפרויקט זה. קו HIPSC, SCVI20, התקבל מג’וזף סי וו, MD, דוקטורט במכון הלב וכלי הדם של סטנפורד במימון NIH R24 HL117756. קו hiPSC, IMR90-4, התקבל ממכון המחקר WiCell55,56.
0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
EDTA | VWR | 45001-122 | |
Ethanol | |||
FGM3 | VWR | 10172-048 | |
GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
Glycine | Sigma | G8898-500G | |
Goat serum | VWR | 10152-212 | |
hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
IPA | |||
IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
MTCS | Sigma | 440299-1L | |
NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
NaOH | Sigma | S5881-500G | |
Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
EVG620 Aligner | EVG | ||
Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
Leica SP8 Confocal microscope | Leica |