פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג’ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.
Abstract
הגורם המוביל למוות ברחבי העולם נמשך כמו מחלות לב וכלי דם (CVD). עם זאת, דוגמנות המורכבות הפיזיולוגית והביולוגית של שריר הלב, שריר הלב, הוא ידוע לשמצה קשה להשיג במבחנה. בעיקר, מכשולים טמונים הצורך קרדיומיוציטים אנושיים (CMs) כי הם מבוגרים או להפגין פנוטיפים דמויי מבוגרים והוא יכול לשכפל בהצלחה את המורכבות התאית של שריר הלב וארכיטקטורה 3D מורכב. למרבה הצער, בשל חששות אתיים וחוסר זמין ראשוני נגזר רקמת לב אנושית, בשילוב עם התפשטות מינימלית של CMs, המקור של CMs אנושי קיימא כבר צעד מגביל עבור הנדסת רקמת לב. לשם כך, רוב המחקרים עברו לבידול לבבי של תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (hiPSCs) כמקור העיקרי של CMs אנושיים, וכתוצאה מכך התאגדות רחבה של hiPSC-CMs בתוך מבחני חוץ למידול רקמת לב.
כאן בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול לפיתוח רקמת לב אנושית בוגרת תלת מימדית שמקורה בתאי גזע בתוך מכשיר מיקרופלואידי. אנו מסבירים באופן ספציפי ומדגימים ויזואלית את הייצור של מודל רקמת לב אניסוטרופית במבחנה במבחנה על שבב מ- CMs שמקורם ב- hiPSC. אנו מתארים בעיקר פרוטוקול טיהור לבחירה עבור CMs, תרבות משותפת של תאים עם יחס מוגדר באמצעות ערבוב CMs עם CFs אנושיים (hCFs), והשעיה של תרבות משותפת זו בתוך הידרוג’ל מבוסס קולגן. אנו מדגימים עוד יותר את ההזרקה של הידרוג’ל עמוס התאים בתוך המכשיר המיקרופלואידי המוגדר היטב שלנו, משובץ במיקרופוסטים אליפטיים מתנדנדים המשמשים כטופוגרפיה של פני השטח כדי לגרום ליישור גבוה של התאים שמסביב ומטריצת ההידרוגל, מחקה את הארכיטקטורה של שריר הלב המקומי. אנו צופים כי מודל הרקמה-על-שבב של הלב הדו-ממדי המוצע מתאים למחקרי ביולוגיה בסיסיים, דוגמנות מחלות, ובאמצעות השימוש בו ככלי סינון, בדיקות פרמצבטיות.
Introduction
גישות הנדסת רקמות נחקרו בהרחבה, בשנים האחרונות, כדי ללוות ממצאים קליניים vivo ברפואה רגנרטיבית ומידול מחלות1,2. דגש משמעותי הושם במיוחד על מידול רקמת לב במבחנה בשל הקשיים הטבועים במיקור רקמת לב ראשונית אנושית והפקת תחליפים במבחנה רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, המגבילים את ההבנה הבסיסית של המנגנונים המורכבים של מחלות לב וכלי דם (CVDs)1,3. מודלים מסורתיים מעורבים לעתים קרובות 2D monolayer תרבות מבחנים. עם זאת, החשיבות של culturing תאי לב בתוך סביבה 3D לחקות הן את הנוף הטבעי של שריר הלב אינטראקציות הסלולר מורכב התאפיין בהרחבה4,5. בנוסף, רוב הדגמים שיוצרו עד כה כללו מונו-תרבות של CMs המובדלים מתאי גזע. עם זאת, הלב מורכב מסוגי תאים מרובים6 בתוך ארכיטקטורה 3D מורכב7, המצדיק את הצורך הקריטי לשפר את המורכבות של הרכב הרקמה בתוך מודלים 3D במבחנה כדי לחקות טוב יותר מרכיבים הסלולר של שריר הלב המקורי.
עד כה, גישות רבות ושונות נחקרו כדי לייצר מודלים ביומימטיים 3D של שריר הלב8. גישות אלה נעות בין הגדרות ניסיוניות המאפשרות חישוב בזמן אמת של כוח שנוצר, מן CMs מונו-תרבות זרע על סרטים דקים (נחשב סרטים דקים שרירים (MTFs))9, כדי co-culture תאי לב מטריצות הידרוג’ל 3D מושעה בין cantilevers העומדים חופשיים (נחשב רקמות לב מהונדסות (EHTs))10. גישות אחרות התמקדו ביישום טכניקות micromolding לחקות anisotropy שריר הלב, מן CMs מונו-תרבות הידרוג’ל 3D מושעה בין microposts בולטים במדבקת רקמה11, כדי מונו-תרבות CMs זרעים בין microgroovesמוסטים 12,13. ישנם יתרונות וחסרונות מובנים לכל אחת משיטות אלה, ולכן, זה רלוונטי לנצל את הטכניקה התואמת את היישום המיועד ואת השאלה הביולוגית המתאימה.
היכולת לשפר את ההבשלה של תאי גזע נגזר CMs חיוני להנדסת במבחנה מוצלחת של רקמת שריר הלב דמוי מבוגר ותרגום של ממצאים הבאים פרשנויות קליניות. למטרה זו, שיטות כדי בוגרת CMs נחקרו נרחב, הן 2D ו 3D14,15,16. לדוגמה, גירוי חשמלי המשולב ב- EHTs, יישור כפוי של CMs עם טופוגרפיה של פני השטח, רמזי איתות, גורמי גדילה מתרבות משותפת ו/או תנאי הידרוג’ל תלת-ממדיים וכו ‘, כולם מובילים לשינוי לטובת התבגרות CM לפחות באחת מהאפשרויות הבאות: מורפולוגיה של תאים, טיפול בסידן, מבנה סרקומרי, ביטוי גנים או כוח התכווצותי.
מבין מודלים אלה, הגישות המשתמשות בפלטפורמות מיקרופלואידיות שומרות על יתרונות מסוימים בטבע, כגון שליטה במעברי צבע, קלט תאים מוגבל וריאנטים מינימליים נחוצים. יתר על כן, משכפלים ביולוגיים רבים יכולים להיווצר בבת אחת באמצעות פלטפורמות microfluidic, המשרתים לנתח טוב יותר את המנגנון הביולוגי של עניין ולהגדיל את גודל המדגם הניסיוני לטובת כוח סטטיסטי17,18,19. בנוסף, שימוש בפוטוליטוגרפיה בתהליך ייצור המכשירים המיקרופלואידיים מאפשר יצירת תכונות מדויקות (למשל טופוגרפיות) ברמת המיקרו והננו, המשמשות כרמזים מזוסקופיים לשיפור המבנה התאי שמסביב וארכיטקטורת רקמות ברמת המאקרו18,20,21,22 עבור יישומים שונים בהתחדשות רקמות ומידול מחלות.
הדגמנו בעבר את הפיתוח של מודל חדש של רקמת לב תלת-ממדית על שבב המשלב טופוגרפיה של פני השטח, בצורה של מיקרופוסטים אליפטיים מולדים, כדי ליישר תאי לב מתורבתים הידרוג’ל-אנקפסולציה לתוך רקמה מחוברת, אניזוטרופית20. לאחר 14 ימים של תרבות, הרקמות שנוצרו בתוך המכשיר המיקרופלואידי בוגרות יותר בפנוטיפ שלהם, פרופיל ביטוי גנים, מאפייני טיפול בסידן ותגובה פרמצבטית בהשוואה לבקרות איזוטרופיות חד שכבתיות ותלת-ממדיות23. הפרוטוקול המתואר בזאת מתאר את השיטה ליצירת רקמת לב אנושית מתורבתת תלת-ממדית זו , המיושרת (כלומר, אניזוטרופית) בתוך המכשיר המיקרופלואידי באמצעות CMs שמקורם ב- hiPSC. באופן ספציפי, אנו מסבירים את השיטות כדי להבדיל ולטהר hiPSCs כלפי CMs, תוספת של hCFs עם CMs כדי לייצר אוכלוסיית תרבות משותפת הוקמה, החדרת אוכלוסיית התא עטוף בתוך הידרוג’ל קולגן לתוך התקנים microfluidic, וניתוח הבא של רקמות 3D בנוי באמצעות מבחנים התכווצות immunofluorescent. מיקרו-רקמות מהונדסות תלת-ממד וכתוצאה מכך מתאימות ליישומים שונים, כולל מחקרי ביולוגיה בסיסיים, מידול CVD ובדיקות פרמצבטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
היווצרות מודל רקמת לב אנושי במבחנה עם אינטראקציות משופרות בין תאי התא ומבנה 3D ביומימטי הוא הכרחי למחקר לב וכלי דם בסיסי ויישומים קליניים מתאימים1. פרוטוקול מתואר זה מסביר את הפיתוח של רקמת לב אניזוטרופית אנושית תלת מימדית בתוך מכשיר מיקרופלואידי, תוך שימוש בתרבות משותפת…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות #1653193 פרס NSF CAREER, פרס ועדת המחקר הביו-רפואי של אריזונה (ABRC) (ADHS18-198872), ופרס קרן פלין על מתן מקורות מימון לפרויקט זה. קו HIPSC, SCVI20, התקבל מג’וזף סי וו, MD, דוקטורט במכון הלב וכלי הדם של סטנפורד במימון NIH R24 HL117756. קו hiPSC, IMR90-4, התקבל ממכון המחקר WiCell55,56.
Materials
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
Riferimenti
- Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
- Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
- LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. . Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, 3-21 (2005).
- Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
- Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
- Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
- Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
- Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
- Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
- Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
- Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Ricerca sul cancro. 7, 3139-3151 (2019).
- Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
- Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
- Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
- Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
- Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
- Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
- Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells – Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn’t the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
- Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
- Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
- Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
- Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
- Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
