Un modello di steatosi sperimentale in vitro:coltura cellulare di epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico

Sommario

Questo protocollo vuole essere uno strumento per studiare la steatosi e i cambiamenti molecolari, biochimici, cellulari prodotti dalla sovraeposizione degli epatociti ai lipidi in vitro.

Abstract

La steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD), precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), è la malattia epatica più diffusa in tutto il mondo a causa della sua relazione con obesità, diabete di tipo 2 e dislipidemia. La steatosi epatica, l'accumulo di goccioline lipidiche nel parenchima epatico, è una caratteristica chiave della malattia che precede l'infiammazione osservata nella steatoepatite, nella fibrosi e nella malattia epatica allo stadio terminale. L'accumulo di lipidi negli epatociti potrebbe interferire con il corretto metabolismo degli xenobiotici e delle molecole endogene, nonché indurre processi cellulari che portano all'avanzamento della malattia. Sebbene lo studio sperimentale della steatosi possa essere eseguito in vivo, gli approcci in vitro allo studio della steatosi sono strumenti complementari con diversi vantaggi. La coltura di epatociti in un mezzo condizionato da sovraccarico lipidico è un'eccellente opzione riproducibile per lo studio della steatosi epatica che consente l'identificazione dei processi cellulari legati all'accumulo lipidico, come stress ossidativo e reticolare, autofagia, proliferazione, morte cellulare, eccetera, nonché altri test tra cui l'efficacia dei farmaci e test tossicologici, tra molte altre possibili applicazioni. Qui, aveva lo scopo di descrivere la metodologia della coltura cellulare degli epatociti in mezzo condizionato da sovraccarico lipidico. Le cellule HepG2 sono state coltivate in terreno RMPI 1640 condizionato con palmitato di sodio e oleato di sodio. È importante sottolineare che il rapporto di questi due lipidi è fondamentale per favorire l'accumulo di goccioline lipidiche, pur mantenendo la proliferazione cellulare e un tasso di mortalità moderato, come accade nel fegato durante la malattia. Viene mostrata la metodologia, dalla preparazione delle scorte di soluzioni lipidiche, dalla miscela, dall'aggiunta al mezzo e dalla coltura degli epatociti. Con questo approccio, è possibile identificare goccioline lipidiche negli epatociti che sono facilmente osservabili dalla colorazione O rosso olio, nonché curve dei tassi di proliferazione / mortalità.

Introduzione

Il fegato grasso associato alla disfunzione metabolica è altamente prevalente in tutto il mondo^1,2; si stima che fino al 25% della popolazione sia colpita³. Questa malattia precedentemente nota come steatosi epatica non alcolica (NAFLD), ha aggiornato la sua nomenclatura alla steatosi epatica associata alla disfunzione metabolica (MAFLD) per riflettere accuratamente la patogenesi correlata all'obesità, all'insulino-resistenza, al diabete di tipo 2 e alla dislipidemia, nonché le possibili gestione della malattia^3,4.

Protocollo

1. Preparazione del mezzo standard e condizionato

1. Per preparare rpmI 1640 standard, integrare il terreno di coltura RPMI 1640 con il 10% (v/v) di siero bovino fetale (FBS, precedentemente inattivato dal calore) e l'1% (v/v) di soluzione di penicillina-streptomicina. Conservare il mezzo a 4 °C.Sterilizzare utilizzando filtri da 0,22 μm.
2. Per preparare la soluzione stock di palmitato, preparare una soluzione di palmitato da 50 mM nello standard RPMI 1640 precedentemente integrato con l'1% di albumina sierica bovina (priva di lipidi). Un volume di 5-10 ml di questo stock sarà sufficiente. Sterilizzare la soluzione stock utilizzando filtri da 0,22 μm. C....

Risultati

Gli epatociti coltivati nel mezzo steatogeno mostrano una crescita su tutta la superficie del pozzo; tuttavia, gli epatociti grassi mostrano un tasso di crescita inferiore rispetto alle cellule coltivate in mezzo di controllo. Il rapporto proposto e la concentrazione di OA e PA, garantiscono la sopravvivenza cellulare durante la coltura. La semina 1 x 10⁵ cellule per pozzetti in piastre a 24 pozzetti fornisce una confluenza ottimale come mostrato nella Figura 1.

Discussione

Questo protocollo ha lo scopo di fornire una strategia per studiare la steatosi in vitro. La coltura cellulare è un potente strumento per studiare gli aspetti cellulari, molecolari, biochimici e tossicologici delle cellule esposte a diverse condizioni. Con questo approccio, la steatosi può essere visualizzata non solo come uno stadio della malattia complessa che è MAFLD, ma anche come la sovraesposizione degli epatociti ai lipidi e i possibili esiti derivanti da tale esposizione. Pertanto, la sua applicazione no.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cabina di sicurezza biologica	ESCO Airstream	AC2-452+C2:C26	Classe II  Tipo A2  Armadio di sicurezza biologica
Filtro per bottiglie	Corning, Stati Uniti	430513	Apirogeno, polistirolo, sterile. 1 filtro/sacchetto. 0,22 μ m, 500 mL.
Siero bovino albimun (BSA)	Gold Biotechnology, US	A-421-10	BSA Senza acidi grassi per colture cellulari
Terreni di coltura RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, US	31800-022-Siero
bovino fetale (FBS)	ThermoFisher-Gibco, US	A4766801-Emocitometro
	Marienfeld, DE	640010-HepG2
linea cellulare	ATCC, US	HB-8065	Cellule umane di carcinoma epatocellulare.
Incubatrice umidificata	Thermo Electronic Corporation, modello USA	: 3110	Temperatura (37 ° C ± 1 ° C), umidità (90% & plusmn; 5%), CO2 (5% ± 1%)
Microscopio invertito Eclipse	NIKON, JPN	Modello: TE2000-S-Isopropanolo
	Sigma-Aldrich, US	I9030-4L-Oil
Red O Kit	Abcam, US	ab150678	Kit per la visualizzazione istologica del grasso neutro.
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich, US	P6148-500G-Penicillina
/streptomicina	ThermoFisher-Gibco, US	15140-122	Antibiotici 10.000 U/mL Penicillina, 10.000 μ g/mL Misuratore di pH della streptomicina
	Beckman, USA	Modello: 360 PH/Temp/MV	Meter-Soluzione
salina tamponata con fosfato	ThermoFisher-Gibco, US	10010-023-Pipette
sierologiche	Sarstedt, AUS	86.1253.001	Pipette sierologiche sterili da 5 mL non pirogene
	Sarstedt, AUS	86.1254.001	Non pirogeno, sterile, 10 mL
di bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich, US	S5761-1KG	Preparazione di terreni di coltura
Oleato di sodio	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215879A-Palmitato
di sodio	Santa Cruz Biotechnology, US	sc-215881-Filtro
Syring	Corning, US	431219	Apirogeno, sterile, 28 mm, 0,2 μm.
Trypan Blue	Sigma-Aldrich, US	T6146-25G-Tripsina
0,05% /EDTA 0,53 mM	Corning, US	25-052-Cl-24
pozzetti cluster di coltura cellulare	Corning, US	3524	Fondo piatto con coperchio. Coltura tissutale trattata. Apirogeno, polistirene, sterile. 1/Confezione.
Cluster di colture cellulari a 96 pozzetti	Corning, US	3599	Fondo piatto con coperchio. Coltura tissutale trattata. Apirogeno, polistirene, sterile. 1/Confezione.