Este artículo describe un método basado en la levitación magnética que puede detectar específicamente la presencia de antígenos, ya sean solubles o unidos a la membrana, cuantificando los cambios en la altura de levitación de las perlas de captura con densidades fijas.
El método descrito se desarrolló en base a los principios de la levitación magnética, que separa las células y las partículas en función de su densidad y propiedades magnéticas. La densidad es una propiedad de identificación de tipo celular, directamente relacionada con su tasa metabólica, diferenciación y estado de activación. La levitación magnética permite un enfoque de un solo paso para separar, obtener imágenes y caracterizar con éxito las células sanguíneas circulantes, y para detectar anemia, enfermedad de células falciformes y células tumorales circulantes en función de la densidad y las propiedades magnéticas. Este enfoque también es susceptible de detectar antígenos solubles presentes en una solución mediante el uso de conjuntos de perlas de baja y alta densidad recubiertas con anticuerpos de captura y detección, respectivamente. Si el antígeno está presente en la solución, une los dos conjuntos de perlas, generando un nuevo complejo de cuentas- cuentas, que levitará entre las filas de cuentas recubiertas de anticuerpos. El aumento de la concentración del antígeno objetivo en solución generará un mayor número de complejos de perlas en comparación con concentraciones más bajas de antígeno, lo que permitirá mediciones cuantitativas del antígeno objetivo. La levitación magnética es ventajosa para otros métodos debido a su menor tiempo de preparación de la muestra y la falta de dependencia de los métodos clásicos de lectura. La imagen generada se captura y analiza fácilmente utilizando un microscopio estándar o un dispositivo móvil, como un teléfono inteligente o una tableta.
La levitación magnética es una técnica desarrollada para separar, analizar e identificar los tipos celulares1,2,3,proteínas4,5 y opioides6 basándose únicamente en su densidad específica y propiedades paramagnéticas. La densidad celular es una propiedad única e intrínseca de cada tipo de célula directamente relacionada con su tasa metabólica y estado de diferenciación7,8,9,10,11,12,13,14. Cuantificar los cambios sutiles y transitorios en la densidad celular durante las condiciones de estado estacionario, y durante una variedad de procesos celulares, podría permitirle a uno una visión inigualable de la fisiología celular y la fisiopatología. Los cambios en la densidad celular se asocian con ladiferenciación celular15,16,la progresión del ciclo celular9,17, 18,19,la apoptosis 20,21,22,23y la transformación maligna24,25,26 . Por lo tanto, la cuantificación de cambios específicos en la densidad celular, se puede utilizar para diferenciar entre células de diferentes tipos, así como discriminar entre un mismo tipo de células sometidas a diversos procesos de activación. Esto permite experimentos dirigidos a una subal población celular en particular, donde los cambios dinámicos en la densidad sirven como un indicador del metabolismo celular alterado27. Como se ha establecido que una célula puede alterar su densidad en respuesta a un entorno cambiante7,es imperativo medir la cinética de la célula en relación con su densidad para entenderla completamente, lo que los métodos actuales pueden no proporcionar12. La levitación magnética, por otro lado, permite una evaluación dinámica de las células y sus propiedades28.
Las células son diamagnéticas, lo que significa que no tienen un momento dipolar magnético permanente. Sin embargo, cuando se expone a un campo magnético externo, se genera un momento dipolar magnético débil en las células, en la dirección opuesta al campo aplicado. Por lo tanto, si las células están suspendidas en una solución paramagnética y expuestas a un fuerte campo magnético vertical, levitarán lejos de la fuente magnética y se detendrán a una altura, que depende principalmente de su densidad individual. La levitación diamagnética de un objeto confinado al mínimo de un campo magnético no homogéneo es posible cuando se cumplen los dos criterios siguientes: 1) la susceptibilidad magnética de la partícula debe ser menor que la del medio circundante, y 2) la fuerza magnética debe ser lo suficientemente fuerte como para contrarrestar la fuerza de flotabilidad de la partícula. Ambos criterios pueden cumplirse suspendiendo los glóbulos rojos en un búfer magnético y creando fuertes gradientes de campo magnético con imanes permanentes pequeños, económicos y disponibles comercialmente1. La posición de equilibrio de una partícula atrapada magnéticamente en un eje a lo largo de la dirección de la gravedad está determinada por su densidad (en relación con la densidad del tampón), su susceptibilidad magnética (en relación con la susceptibilidad magnética del tampón) y la firma del campo magnético aplicado. Como la densidad y las propiedades magnéticas de la solución son constantes en todo el sistema, las propiedades de densidad intrínseca de las células serán el factor principal que determine la altura de levitación de las células, con células más densas que levitan más bajas en comparación con las células menos densas. Este enfoque utiliza un conjunto de dos cuentas de referencia de densidad (1,05 y 1,2 g/ml) que nos permite utilizar un análisis preciso y ratiométrico para las mediciones de densidad. Alterar la concentración de la solución magnética permite aislar diferentes poblaciones celulares, como los glóbulos rojos de los glóbulos blancos, ya que la densidad de las células circulantes es específica de la célula, eliminando la necesidad de protocolos de aislamiento u otra manipulación celular.
La mayoría de los métodos de detección utilizados en la investigación biología se basan en la extrapolación de eventos de unión específicos en señales lineales fáciles de cuantificar. Estos métodos de lectura son a menudo complejos e involucran equipos especializados y personal científico dedicado. Aquí se describe un enfoque dirigido a la detección de antígenos que se encuentran en la membrana plasmática de las células o vesículas extracelulares o que son solubles en plasma, utilizando una o dos perlas recubiertas de anticuerpos. Las cuentas deben ser de diferentes densidades entre sí y de las de los objetivos interrogados. La presencia del antígeno objetivo en cualquier biofluido dado se traduce en un cambio específico y medible en la altura de levitación de una célula positiva para antígeno que está unida a una cuenta de detección. En el caso de antígenos solubles o vesículas extracelulares, están unidas tanto a cuentas de captura como de detección, formando un complejo de cuentas-cuentas en lugar de un complejo de perlas-células. El cambio en la altura de levitación depende de la nueva densidad de los complejos de células de cuentas o cuentas. Además del cambio en la altura de levitación de los complejos, que indica la presencia de antígeno en el biofluido, el número de complejos también depende de la cantidad de objetivo, lo que hace que la levitación magnética también sea un enfoque cuantitativo para la detección de antígenos24.
La centrifugación por gradiente es actualmente la técnica estándar para aislar componentes subcelulares en función de sus densidades únicas. Este enfoque, sin embargo, requiere el uso de medios de gradiente especializados, así como equipos de centrífuga. El enfoque de levitación magnética presentado aquí permite una investigación detallada de las propiedades morfológicas y funcionales de las células circulantes, con una manipulación mínima, si es que hay alguna, de las células, proporcionando un acceso <e…
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer al Dr. Getulio Pereira por su ayuda con el trabajo de vesículas extracelulares.
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones del Instituto Nacional de Salud al ICG: RO1CA218500, UG3HL147353 y UG3TR002881.
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
50×2.5×1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |