स्फिंगोलिपिड्स मानव रोग में अच्छी तरह से स्थापित भूमिकाओं के साथ बायोएक्टिव मेटाबोलाइट्स हैं। मास-स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ ऊतकों में परिवर्तन की विशेषता रोग एटियलजि में भूमिकाओं को प्रकट कर सकती है या चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान कर सकती है। हालांकि, बायोरिपॉजिटरी में क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए उपयोग किया जाने वाला ओसीटी-यौगिक मास-स्पेक्ट्रोमेट्री में हस्तक्षेप करता है। हम एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस के साथ ओसीटी में एम्बेडेड मानव ऊतकों में स्फिंगोलिपिड्स का विश्लेषण करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करते हैं।
स्फिंगोलिपिड्स सेलुलर घटक हैं जिनकी मानव चयापचय और बीमारी में अच्छी तरह से स्थापित भूमिकाएं हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या किसी बीमारी में स्फिंगोलिपिड्स बदल जाते हैं और जांच करते हैं कि क्या स्फिंगोलिपिड्स को चिकित्सकीय रूप से लक्षित किया जा सकता है। हालांकि, सर्जिकल सूट से सीधे ऊतकों को प्राप्त करने वाले उचित रूप से संचालित भावी अध्ययन समय लेने वाले हो सकते हैं, और तकनीकी रूप से, तार्किक और प्रशासनिक रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। इसके विपरीत, पूर्वव्यापी अध्ययन पहले से ही उपलब्ध क्रायोप्रिजर्व्ड मानव नमूनों का लाभ उठा सकते हैं, आमतौर पर बड़ी संख्या में, ऊतक बायोरिपॉजिटरी में। बायोरिपॉजिटरी से ऊतकों की खरीद के अन्य फायदों में ऊतक के नमूनों से जुड़ी जानकारी तक पहुंच शामिल है जिसमें हिस्टोलॉजी, पैथोलॉजी और कुछ उदाहरणों में क्लिनिकोपैथोलॉजिकल चर शामिल हैं, जिनमें से सभी का उपयोग लिपिडोमिक्स डेटा के साथ सहसंबंधों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, क्रायोप्रिजर्वेशन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री में उपयोग किए जाने वाले इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) की असंगति से संबंधित तकनीकी सीमाएं लिपिड के विश्लेषण के लिए एक तकनीकी बाधा है। हालांकि, हमने पहले दिखाया है कि ओसीटी को मानव बायोरिपोजिटरी नमूनों से उनकी स्फिंगोलिपिड सामग्री को बदले बिना धोने और सेंट्रीफ्यूजेशन के चक्रों के माध्यम से आसानी से हटाया जा सकता है। हमने पहले यह भी स्थापित किया है कि ओसीटी में क्रायोप्रिजर्व किए गए मानव ऊतकों में स्फिंगोलिपिड्स 16 साल तक स्थिर हैं। इस रिपोर्ट में, हम मानव ऊतक नमूनों में स्फिंगोलिपिड्स का विश्लेषण करने के लिए चरणों और वर्कफ़्लो को रेखांकित करते हैं जो ओसीटी में एम्बेडेड हैं, जिसमें ऊतकों को धोना, डेटा सामान्यीकरण के लिए ऊतकों का वजन करना, लिपिड का निष्कर्षण, तरल क्रोमैटोग्राफी इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस), मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एकीकरण, डेटा सामान्यीकरण और डेटा विश्लेषण द्वारा विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करना शामिल है।
स्फिंगोलिपिड्स बायोएक्टिव मेटाबोलाइट्स हैं जो मानव चयापचय और रोग 1,2 में उनकी भूमिकाओं के लिए जाने जाते हैं। वे जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं जैसे सेल माइग्रेशन, सेल अस्तित्व और मृत्यु, सेल आंदोलन, वेसिकुलर ट्रैफिकिंग, सेलुलर आक्रमण और मेटास्टेसिस, एंजियोजेनेसिस और साइटोकिन्सके उत्पादन को नियंत्रित करते हैं 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . स्फिंगोलिपिड चयापचय के विनियमन में दोष कैंसर की शुरुआत और प्रगति में योगदान करते हैं, यह निर्धारित करते हैं कि आक्रामक कैंसर कितने आक्रामक हैं, और कैंसर चिकित्सा के प्रतिरोध का जवाब कैसेदेते हैं और विकसित करते हैं 3,10. इसलिए, रोग के एटियलजि पर इन व्यापक प्रभावों के कारण, विश्लेषणात्मक तरीके जो रोग-विशिष्ट स्फिंगोलिपिड परिवर्तनों को ठीक से स्थापित कर सकते हैं, महत्वपूर्ण उपकरण हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) स्फिंगोलिपिड परिवर्तनों का विश्लेषण करने के लिए सबसे सटीक और विश्वसनीय तरीका है।
मानव नमूने जिनका उपयोग स्फिंगोलिपिड परिवर्तनों के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, उन्हें सर्जिकल सूट से या पूर्वव्यापी रूप से ऊतक बायोरिपॉजिटरी से प्राप्त किया जा सकता है। सर्जरी से ताजा ऊतक फायदेमंद होते हैं क्योंकि उन्हें सीधे एमएस या अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है। हालांकि, भावी प्रभाव से ऊतकों को प्राप्त करने में प्रशासनिक, तकनीकी और तार्किक बाधाएं हैं, और सांख्यिकीय शक्ति तक पहुंचने के लिए पर्याप्त नमूने एकत्र करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। बायोरिपॉजिटरी से ऊतकों को प्राप्त करना फायदेमंद है क्योंकि उन्हें पूर्वव्यापी रूप से, बड़ी संख्या में अधिग्रहित किया जा सकता है, और बायोरिपॉजिटरी हिस्टोलॉजी और पैथोलॉजी की पुष्टि करते हैं, क्रायोजेनिक रूप से संरक्षित और संग्रहीत ऊतकों के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं का उपयोग करते हैं, और क्लिनिकोपैथोलॉजिकल डेटा प्रदान कर सकते हैं जिसका उपयोग सहसंबंध विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। हालांकि, आणविक और संरचनात्मक विशेषताओं को संरक्षित करने के लिए, बायोरिपॉजिटरी इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) यौगिक में उन्हें एम्बेड करके ऊतकों को क्रायोप्रिजर्व कर सकते हैं, जिसे हमने दिखाया है कि डेटा सामान्यीकरण परख और तरल क्रोमैटोग्राफी इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण टेंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-ईएसआई-एमएस / एमएस) 11 द्वारा स्फिंगोलिपिड्स की मात्रा का ठहराव में हस्तक्षेप करता है। . यह भी दिखाया गया है कि ओसीटी यौगिक में प्राथमिक घटक पॉलीविनाइल अल्कोहल और पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल, अन्य एमएस विश्लेषण प्लेटफार्मों12,13,14,15 में आयन दमन का परिणाम है। इसलिए, एमएस द्वारा स्फिंगोलिपिडोमिक विश्लेषण से पहले ओसीटी यौगिक को ऊतकों से हटा दिया जाना चाहिए।
पिछली रिपोर्ट में, हमने एलसी-ईएसआई-एमएस /एमएस विश्लेषण 11 के लिए मानव नमूनों से ओसीटी यौगिक को हटाने के लिए एक प्रोटोकॉल औरडेटा सामान्यीकरण 11 के लिए ऊतकों को तौलने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को मान्य किया है। यहां, हम स्फिंगोलिपिडोमिक ओसीटी यौगिक-निष्कासन प्रोटोकॉल (एसओसीटीआरपी) के चरणों का विस्तार करते हैं और मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा ट्यूमर और सामान्य आसन्न असंबद्ध ऊतकों से प्रतिनिधि डेटा दिखाते हैं।
ओसीटी एक सामान्य दीर्घकालिक क्रायो-संरक्षण एजेंट है जिसका उपयोग बायोरिपॉजिटरी में किया जाता है। हालांकि, ओसीटी के परिणामस्वरूप आयन दमन हो सकता है जब ऊतकों का विश्लेषण विभिन्न मास स्पेक्ट्रोमेट्री ?…
The authors have nothing to disclose.
अनुसंधान परियोजना की सेवाएं और समर्थन वीसीयू मैसी कैंसर सेंटर ऊतक और डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कोर और वीसीयू लिपिडोमिक्स और मेटाबोलॉमिक्स कोर द्वारा प्रदान किए गए थे, जो एनआईएच-एनसीआई कैंसर सेंटर सपोर्ट ग्रांट पी 30सीए016059 से वित्त पोषण के साथ आंशिक रूप से समर्थित हैं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट्स आर 21सीए 232234 (सैंटियागो लीमा) द्वारा समर्थित किया गया था।
1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |