تحضير الأنسجة البشرية المضمنة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل لتحليل مطياف الكتلة
Summary
Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا لها أدوار راسخة في الأمراض البشرية. يمكن أن يكشف توصيف التغيرات في الأنسجة باستخدام قياس الطيف الكتلي عن أدوار في مسببات المرض أو تحديد الأهداف العلاجية. ومع ذلك ، فإن مركب OCT المستخدم للحفظ بالتبريد في المستودعات الحيوية يتداخل مع قياس الطيف الكتلي. نحدد طرقا لتحليل الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المضمنة في OCT باستخدام LC-ESI-MS / MS.
Abstract
Sphingolipids هي مكونات خلوية لها أدوار راسخة في التمثيل الغذائي البشري والمرض. يمكن استخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد ما إذا كانت الدهون السفينغولية تتغير في المرض والتحقيق فيما إذا كان يمكن استهداف السفينغوليبيدات سريريا. ومع ذلك ، فإن الدراسات المستقبلية التي تعمل بالطاقة بشكل صحيح والتي تكتسب الأنسجة مباشرة من الجناح الجراحي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا ، وتحديا تقنيا ولوجستيا وإداريا. في المقابل ، يمكن للدراسات بأثر رجعي الاستفادة من العينات البشرية المحفوظة بالتبريد المتاحة بالفعل ، عادة بأعداد كبيرة ، في المستودعات الحيوية للأنسجة. تشمل المزايا الأخرى لشراء الأنسجة من المستودعات الحيوية الوصول إلى المعلومات المرتبطة بعينات الأنسجة بما في ذلك الأنسجة وعلم الأمراض وفي بعض الحالات المتغيرات السريرية المرضية ، والتي يمكن استخدامها جميعا لفحص الارتباطات مع بيانات الدهون. ومع ذلك ، فإن القيود التقنية المتعلقة بعدم توافق مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) المستخدم في الحفظ بالتبريد وقياس الطيف الكتلي هي حاجز تقني لتحليل الدهون. ومع ذلك ، فقد أظهرنا سابقا أنه يمكن إزالة OCT بسهولة من عينات المستودع الحيوي البشري من خلال دورات الغسيل والطرد المركزي دون تغيير محتواها من السفينغوليبيد. لقد أثبتنا سابقا أن الدهون السفينغولية في الأنسجة البشرية المحفوظة بالتبريد في OCT مستقرة لمدة تصل إلى 16 عاما. في هذا التقرير ، نحدد الخطوات وسير العمل لتحليل الدهون السفينغولية في عينات الأنسجة البشرية المضمنة في OCT ، بما في ذلك أنسجة الغسيل ، ووزن الأنسجة لتطبيع البيانات ، واستخراج الدهون ، وإعداد العينات للتحليل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة التأين بالرش الكهربائي لقياس الطيف الكتلي الترادفي (LC-ESI-MS / MS) ، تكامل بيانات قياس الطيف الكتلي ، تطبيع البيانات ، وتحليل البيانات.
Introduction
Sphingolipids هي مستقلبات نشطة بيولوجيا معروفة بأدوارها في التمثيل الغذائي البشري والمرض 1,2. أنها تنظم العمليات الخلوية المعقدة مثل هجرة الخلايا ، وبقاء الخلية وموتها ، وحركة الخلايا ، والاتجار الحويصلي ، والغزو الخلوي وورم خبيث ، وتكوين الأوعية ، وإنتاج السيتوكينات1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تساهم العيوب في تنظيم استقلاب السفينغوليبيد في بدء السرطانات وتطورها ، وتحديد مدى عدوانية السرطانات ، وكيف تستجيب السرطانات للعلاج وتطور مقاومته 3,10. لذلك ، بسبب هذه التأثيرات الواسعة على مسببات المرض ، فإن الطرق التحليلية التي يمكن أن تحدد بدقة تغيرات السفينغوليبيد الخاصة بالمرض هي أدوات مهمة. قياس الطيف الكتلي (MS) هو الطريقة الأكثر دقة وموثوقية لتحليل تغيرات السفينغوليبيد.
يمكن الحصول على العينات البشرية التي يمكن استخدامها لتحليل تغيرات السفينغوليبيد بشكل مستقبلي من الجناح الجراحي أو بأثر رجعي من المستودعات الحيوية للأنسجة. الأنسجة الطازجة من الجراحة مفيدة لأنه يمكن تحليلها مباشرة عن طريق مرض التصلب العصبي المتعدد أو طرق تحليلية أخرى. ومع ذلك ، فإن الحصول على الأنسجة بشكل مستقبلي ينطوي على عقبات إدارية وتقنية ولوجستية ، وقد يكون جمع عينات كافية للوصول إلى القوة الإحصائية أمرا صعبا. يعد الحصول على الأنسجة من المستودعات الحيوية مفيدا لأنه يمكن الحصول عليها بأثر رجعي ، بأعداد كبيرة ، وتؤكد المستودعات الحيوية علم الأنسجة وعلم الأمراض ، وتستخدم إجراءات التشغيل القياسية للحفاظ على الأنسجة وتخزينها بالتبريد ، ويمكن أن توفر بيانات سريرية مرضية يمكن استخدامها لتحليلات الارتباط. ومع ذلك ، للحفاظ على السمات الجزيئية والهيكلية ، قد تحافظ المستودعات الحيوية على الأنسجة بالتبريد عن طريق تضمينها في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ، والذي أظهرنا أنه يتداخل مع مقايسات تطبيع البيانات والقياس الكمي للسفينغوليبيدات بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي الترادفي للتأين بالرش الكهربائي (LC-ESI-MS / MS)11 . وقد تبين أيضا أن كحول البولي فينيل والبولي إيثيلين جلايكول ، المكونات الأساسية في مركب OCT ، تؤدي إلى قمع الأيونات في منصات تحليل MS الأخرى12،13،14،15. لذلك ، يجب إزالة مركب OCT من الأنسجة قبل تحليل sphingolipidomic بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد.
في تقرير سابق ، قمنا بالتحقق من صحة بروتوكول لإزالة مركب OCT من العينات البشرية لتحليل LC-ESI-MS / MS11 والمنهجية المستخدمة لوزن الأنسجة لتطبيع البيانات11. هنا ، نقوم بتفصيل خطوات بروتوكول إزالة مركب OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ونعرض بيانات تمثيلية من أورام سرطان الرئة الغدي البشري والأنسجة الطبيعية المجاورة غير المصابة.
Protocol
Representative Results
Discussion
OCT هو عامل شائع للحفاظ على التبريد على المدى الطويل يستخدم في المستودعات الحيوية. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي OCT إلى قمع الأيونات عندما يتم تحليل الأنسجة بواسطة منصات قياس الطيف الكتلي المختلفة12،13،14،15 ، أو يؤدي إلى فقدان الإشارة ع?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تقديم الخدمات والدعم للمشروع البحثي من قبل مركز VCU Massey للسرطان للحصول على الأنسجة والبيانات وتحليلها الأساسية و VCU Lipidomics and Metabolomics Core ، والتي يتم دعمها جزئيا بتمويل من منحة دعم مركز السرطان NIH-NCI P30CA016059. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية R21CA232234 (سانتياغو ليما).
Materials
| 1 mL polypropylene pipette tips | NA | NA | Used to retrieve specimens |
| 1.5 mL polypropylene centrifuge tubes | NA | NA | |
| 10 mL Erlenmeyer flask | VWR | 89091-116 | Used for tube and tissue weighing |
| AB Sciex Analyst 1.6.2 | Sciex | NA | Software to analyze and integrate MS data |
| Ammonium formate | Fisher Scientific | A11550 | For LC mobile phases |
| Analytical scale | NA | NA | Scale that is accurate to 0.1 mg |
| Bottle top dispenser | Sartorius | LH-723071 | Used for dispensing solvents |
| C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine | Avanti Polar Lipids | LM2212 | Internal standard |
| C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine | Avanti Polar Lipids | LM2511 | Internal standard |
| C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene | Avanti Polar Lipids | LM2512 | Internal standard |
| C12-Sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | LM2312 | Internal standard |
| CHLOROFORM OMNISOLV 4L | VWR | EM-CX1054-1 | |
| ClickSeal Biocontainment Lids | Thermo Scientific | 75007309 | To prevent biohazard aeresols during centrifugation |
| Conflikt | Decon Labs | 4101 | Decontaminant |
| CTO-20A/20AC Column Oven | Shimadzu | NA | For LC |
| d17:1-Sphingosine; (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol | Avanti Polar Lipids | LM2000 | Internal standard |
| d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate | Avanti Polar Lipids | LM2144 | Internal standard |
| DGU20A5R degasser | Shimadzu | NA | |
| Disposable Culture Tubes 13x100mm | VWR | 53283-800 | 13×100 mm screw top tubes |
| Heated water bath | NA | NA | For overnight lipid extraction |
| Homogenizer 150 | Fisher Scientific | 15-340-167 | triturate tissues |
| Homogenizer Plastic Disposable Generator Probe | Fisher Scientific | 15-340-177 | for homogenization |
| Kimwipes | Kimtech | 34120 | Laboratory grade tissue used to make wicks |
| Methanol LC-MS Grade 4L | VWR | EM-MX0486-1 | |
| Nexera LC-30 AD binary pump system | Shimadzu | NA | For LC-MS |
| Permanent marker | VWR | 52877-310 | |
| Phenolic Screw Thread Closure, Kimble Chase (caps for disposable culture tubes) | VWR | 89001-502 | 13×100 mm screw top tube caps |
| Phosphate bufffered saline | Thermo Scientific | 10010023 | To retrieve specimens from tubes after washing |
| Repeater pipette | Eppendorf | 4987000118 | To dispense LC-MS internal standards |
| Screw Caps, Blue, Red PTFE/White Silicone | VWR | 89239-020 | Autoinjector vial caps |
| Screw Thread Glass Vials with ID Patch | VWR | 46610-724 | Autoinjector vials |
| SIL-30AC autoinjector | Shimadzu | NA | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | SPD2030P1220 | For drying solvents |
| Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 column | Sigma Aldrich | 53822-U | For LC-MS |
| Triple Quad 5500+ LC-MS/MS System | Sciex | NA | For LC-ESI-MS/MS |
| Ultrasonic water bath | Branson | Model 2800 | for homogenization and resuspension of extracted and dried lipids |
| Vortexer | NA | NA | For sOCTrP and resuspending dried lipids |
| VWR Culture Tubes Disposable Borosilicate Glass | VWR | 47729572 | 13×100 glass culture tubes |
| Water Hipersolve Chromanorm LC-MS | VWR | BDH83645.400 |
Riferimenti
- Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
- Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
- Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
- Hla, T., Dannenberg, A. J. Sphingolipid signaling in metabolic disorders. Cell Metabolism. 16 (4), 420-434 (2012).
- Lima, S., Milstien, S., Spiegel, S. Sphingosine and Sphingosine Kinase 1 involvement in endocytic membrane Trafficking. The Journal of Biological Chemistry. 292 (8), 3074-3088 (2017).
- Lima, S., et al. TP53 is required for BECN1- and ATG5-dependent cell death induced by sphingosine kinase 1 inhibition. Autophagy. , 1-50 (2018).
- Young, M. M., et al. Sphingosine Kinase 1 cooperates with autophagy to maintain endocytic membrane trafficking. Cell Reports. 17 (6), 1532-1545 (2016).
- Young, M. M., Wang, H. G. Sphingolipids as regulators of autophagy and endocytic trafficking. Advances in Cancer Research. 140, 27-60 (2018).
- Shen, H., et al. Coupling between endocytosis and sphingosine kinase 1 recruitment. Nature Cell Biology. 16 (7), 652-662 (2014).
- Morad, S. A. F., Cabot, M. C., Chalfant, C. E., Fisher, P. B. . Advances in Cancer Research. 140, 235-263 (2018).
- Rohrbach, T. D., et al. A simple method for sphingolipid analysis of tissues embedded in optimal cutting temperature compound. Journal of Lipid Research. 61 (6), 953-967 (2020).
- Weston, L. A., Hummon, A. B. Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes. Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).
- Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -. U., Segersten, U., Lind, S. B. Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods. Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).
- Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS. Methods. 81, 50-55 (2015).
- Shah, P., et al. Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).
