JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Biologia

In vitro Tredimensjonal spiringsanalyse av angiogenese ved bruk av musembryonale stamceller for vaskulær sykdomsmodellering og narkotikatesting

Published: May 11, 2021
doi:
10.3791/62554
, , ,
1Einthoven Laboratory for Experimental Vascular Medicine, Department of Internal Medicine (Nephrology),Leiden University Medical Center, 2Institute Physics for Medicine Paris,INSERM U1273, ESPCI Paris, CNRS FRE 2031, 3MEMOLIFE Laboratory of Excellence and PSL Research University

Summary

Denne analysen benytter musembryonale stamceller differensiert i embryoidlegemer dyrket i 3D-kollagengel for å analysere de biologiske prosessene som styrer spirende angiogenese in vitro. Teknikken kan brukes til å teste medisiner, modellere sykdommer, og for å studere spesifikke gener i sammenheng med delesjoner som er embryonisk dødelige.

Abstract

Nylige fremskritt innen induserte pluripotente stamceller (iPSC) og genredigeringsteknologier muliggjør utvikling av nye humane cellebaserte sykdomsmodeller for fenotypisk legemiddeloppdagelse (PDD) -programmer. Selv om disse nye enhetene kunne forutsi sikkerheten og effekten av undersøkelsesmedisiner hos mennesker mer nøyaktig, er deres utvikling til klinikken fortsatt sterkt avhengig av pattedyrdata, særlig bruk av musesykdomsmodeller. Parallelt med humane organoide eller organ-on-chip sykdomsmodeller, er utviklingen av relevante in vitro musemodeller derfor et udekket behov for å evaluere direkte legemiddeleffekt og sikkerhetssammenligninger mellom arter og in vivo og in vitro forhold . Her beskrives en vaskulær spiringsanalyse som benytter museembryonale stamceller differensiert i embryoidlegemer (EB). Vaskulariserte EBer dyrket på 3D-kollagen gel utvikler nye blodkar som ekspanderer, en prosess som kalles spirende angiogenese. Denne modellen rekapitulerer viktige trekk ved in vivo spirende angiogenesedannelse av blodkar fra et eksisterende vaskulært nettverk – inkludert endotelcellevalg, endotelcellemigrasjon og proliferasjon, celleveiledning, rørdannelse og rekruttering av veggmalericeller. Det er egnet til screening for legemidler og gener som modulerer angiogenese og viser likheter med nylig beskrevne tredimensjonale (3D) vaskulære analyser basert på humane iPSC-teknologier.

Introduction

I de siste tre tiårene har målbasert legemiddeloppdagelse (TDD) vært mye brukt i legemiddelforskning av farmasøytisk industri. TDD inkorporerer et definert molekylært mål som spiller en viktig rolle i en sykdom og er avhengig av utvikling av relativt enkle cellekultursystemer og avlesninger for legemiddelscreening1. De fleste typiske sykdomsmodeller som brukes i TDD-programmer inkluderer tradisjonelle cellekulturmetoder som kreftceller eller immortaliserte cellelinjer dyrket i kunstige miljøer og ikke-fysiologiske substrater. Selv om mange av disse modellene har gitt levedyktige verktøy for å identifisere vellykkede legemiddelkandidater, kan bruken av slike systemer være tvilsom på grunn av deres dårlige sykdomsrelevans2.

For de fleste sykdommer er de underliggende mekanismene faktisk komplekse, og forskjellige celletyper, uavhengige signalveier og flere sett med gener er ofte funnet å bidra til en bestemt sykdomsfenotype. Dette gjelder også for arvelige sykdommer der den primære årsaken er en mutasjon i ett enkelt gen. Med den nylige adventen av humaninduserte pluripotente stamcelleteknologier (iPSC) og genredigeringsverktøy, er det nå mulig å generere 3D-organoider og organ-on-chip sykdomsmodeller som bedre kan rekapitulere in vivo menneskelig kompleksitet 3,4. Utviklingen av slike teknologier er forbundet med en gjenoppblomstring i interessen for fenotypisk legemiddeloppdagelse (PDD) -programmer1. PDD kan sammenlignes med empirisk screening, da de ikke er avhengige av kunnskap om identiteten til et bestemt legemiddelmål eller en hypotese om dens rolle i sykdom. PDD-tilnærmingen er nå i økende grad anerkjent for å sterkt bidra til oppdagelsen av førsteklasses medisiner5. Fordi utviklingen av humane organoid- og organ-on-chip-teknologier fortsatt er i sin barndom, forventes det at iPSC-modeller (supplert med innovative bildebehandlings- og maskinlæringsverktøy6,7) i nær fremtid vil gi flere nye komplekse cellebaserte sykdomsmodeller for narkotikascreening og tilhørende PDD-programmer for å overvinne den dårlige produktiviteten til TDD-tilnærmingen8, 9.

Mens humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan gi viktig innsikt i sykdomskompleksitet og identifisering av nye legemidler, er det å bringe medisiner inn i ny klinisk praksis også sterkt avhengig av data fra dyremodeller for å vurdere deres effekt og sikkerhet. Blant dem er genmodifiserte mus absolutt de mest foretrukne pattedyrmodellene. De har mange fordeler da de har en relativt kort generasjonstid for pattedyr, har mange lignende fenotyper til menneskelige sykdommer, og kan lett genetisk manipuleres. De er derfor mye brukt i narkotikaoppdagelsesprogrammer10. Å bygge bro mellom mus og mennesker er imidlertid fortsatt en viktig utfordring11. Utviklingen av in vitro musemodeller tilsvarende humane organoid- og organ-on-chip-modeller kan i det minste delvis fylle dette gapet, da det vil muliggjøre direkte sammenligning av legemiddeleffekt og sikkerhet mellom in vivo mus og in vitro humane data.

Her beskrives en vaskulær spiringsanalyse i museembryoidlegemer (EB). Blodkar består av endotelceller (indre foring av karvegger), veggmalericeller (vaskulære glatte muskelceller og pericytter)12. Denne protokollen er basert på differensiering av musembryonale stamceller (mESC) til vaskulariserte EBer ved bruk av hengende dråper som rekapitulerer de novo endotelcelle- og veggmalericelledifferensiering13,14. Mus ESC kan enkelt etableres i kultur fra isolert dag 3.5 mus blastocyster med forskjellig genetisk bakgrunn15. De gir også muligheter for klonal analyse, avstamningssporing, og kan lett genetisk manipuleres for å generere sykdomsmodeller13,16.

Siden blodkar nærer alle organer, er det ikke overraskende at mange sykdommer, om ikke alle, er forbundet med endringer i mikrovaskulaturen. Under patologiske forhold kan endotelceller vedta en aktivert tilstand eller bli dysfunksjonelle, noe som resulterer i veggmalericelledød eller migrasjon bort fra blodkar. Disse kan resultere i overdreven angiogenese eller i karets sjeldenhet, kan indusere unormal blodstrøm og defekt blodkarbarriere som fører til ekstravasasjon av immunceller og betennelse12,17,18,19. Forskning for utvikling av medikamentmodulerende blodkar er derfor høy, og flere molekylære aktører og konsepter er allerede identifisert for terapeutisk målretting. I denne sammenheng er den beskrevne protokollen spesielt egnet for å bygge sykdomsmodeller og for narkotikatesting, da den rekapitulerer viktige trekk ved in vivo spirende angiogenese, inkludert endotelspiss og stengelcellevalg, endotelcellemigrasjon og proliferasjon, endotelcelleveiledning, rørdannelse og rekruttering av veggmalericeller. Det viser også likheter med nylig beskrevne 3D vaskulære analyser basert på humane iPSC-teknologier20.

Protocol

1. Medieforberedelse og kultur av mESC Forbered betinget medium +/- (CM +//-) ved hjelp av supplement 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) medium med 10% (vol / vol) varmeinaktivert Fetal Bovine Serum (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanol, 1x ikke-essensielle aminosyrer (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat. Klargjør betinget medium +/+ (CM+/+) ved bruk av tilskuddet CM+/- medium med leukemihemmende faktor (LIF) (1 500 U/ml) og 0,1 mM β-merkaptoetanol. Forbered betinget medium +/+ i nærv?…

Representative Results

Protokolloversikten over blodkarspiringsanalysen er vist i figur 1. Ni dager gamle EB-er avledet fra tre uavhengige 129/Ola mESC-linjer (Z/Red, R1 og E14) ble enzymatisk dissosiert til enkeltceller ved bruk av kollagenase A. Celler ble farget for PECAM-1 og analysert ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) som beskrevet. Alle cellelinjene viste robust endoteldifferensiering, og ingen forskjeller i deres evne til å differensiere til endotelceller ble observert. Alle cellelinjene produs…

Discussion

Denne protokollen beskriver en objektiv, robust og reproduserbar 3D EB-basert vaskulær spiringsanalyse som er egnet til screening for legemidler og gener som modulerer angiogenese. Denne metoden gir fordeler i forhold til mange mye brukte todimensjonale (2D) analyser ved bruk av endotelcellekulturer som Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) for å overvåke migrasjon (lateral scratch assay eller Boyden chamber assay)22,23 eller spredning (telling av cellenummer, påvisning av DNA-syntese, påvisning…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, og av Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).

Materials

2-mercaptoethanol Milipore, Merck 805740 Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble Difco, BD Pharmigen 214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG Life technologies A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95) BD Biosciences 553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) Peprotech 450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R Beckman Coulter 392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) Telstar 133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm Marienfeld 640211
Cell culture dishes 60 x 15mm Corning 353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm Corning 353801
Cell culture plates 12-well Corning 3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Biorad 1855196
Chicken serum Sigma-Aldrich C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl Selleckchem S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg Corning 354249
Collagenase A Roche 10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm Vwr 631-0146
DAPT γ‑secretase inhibitor Sigma Aldrich D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone BioXcell BP0060
DC101 isotype rat IgG1 BioXcell BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2438-5X Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium Gibco, Thermofisher scientific 14200067
EDTA 40 mM Gibco, Thermofisher scientific 15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum Gibco, Thermofisher scientific 16141-079 Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R Eppendorf AG  Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) Roche 11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units  1 mL) Milipore, Merck ESG1107
Falcon tubes 15 mL Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mL Greiner Bio-0ne 227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 Greiner Bio-One 739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 Greiner Bio-One 771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 Greiner Bio-One 740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) Sigma Aldrich F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) Biolegend 103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) Biolegend 400605
Fluorscent mounting media DAKO S3023
Gascompress Cutisoft 45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm Bsn Medical 45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003 Whatman WHA10547922
Gelatin solution, type B Sigma-Aldrich G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM) Gibco, Thermofisher scientific 21710082
IHC Zinc Fixative BD Pharmigen 550523
IncuSafe CO2 Incubator PHCBi MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6) Roche 11138600001
L-Glutamine 200 mM Gibco, Thermofisher scientific 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Gibco, Thermofisher scientific 11140035
Microscope slide box Kartell Labware 278
Microscope slide, Starfrost Knittel glass VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer Qiagen QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay Qiagen QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M) Gibco, Thermofisher scientific A24903 Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) ATCC SCRC-1033 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14 Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) ATCC SCRC-1011 Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer Thermo Fischer Scientific ND-1000
PD0325901 Selleckchem S1036
PDGF-BB, Recombinant Human Peprotech 100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse BD Biosciences 550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) Gibco, Thermofisher scientific 15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile Greiner Bio-One 633181
Pipetboy acu 2 Integra-Biosciences 155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G Gilson F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G Gilson F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP
RNeasy Plus mini Kit QIAGEN 74134
Serological pipettes, 10 mL Greiner Bio-One 607 180
Serological pipettes, 25 mL Greiner Bio-One 760 180
Serological pipettes, 5 mL Greiner Bio-One 606 180
Sodium hydroxide (NaOH) Merck 106498
Sodium pyruvate 100 mM Gibco, Thermofisher scientific 11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap Corning 352235
Thermal cycler, T100 Biorad 1861096
Triton X-100 (BioXtra) Sigma Aldrich T9284
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco, Thermofisher scientific 15250061
Trypsin (2.5%) Gibco, Thermofisher scientific 15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL Corning 430758
VEGFA165 , recombinant murine Peprotech 450-32
Water, Sterile Fresenius-Kabi B230531
Waterbath, Lab-Line Digital Thermo Fischer Scientific 18052A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington’s disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioingegneria. 7 (1), 17 (2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Tags

In VitroSprouting AngiogenesisMouse Embryonic Stem CellsVascular Disease ModelingDrug TestingEndothelial Tip CellsCell MigrationGenetic ScreeningPluripotencyKaryotypingMesoderm DifferentiationLow Attachment Polystyrene Dishes
check_url/it/62554?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Galaris, G., Thalgott, J. H., Teston, E., Lebrin, F. P. In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing. J. Vis. Exp. (171), e62554, doi:10.3791/62554 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image