In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos
Summary
Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.
Abstract
Avanços recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) e tecnologias de edição de genes permitem o desenvolvimento de novos modelos de doenças baseadas em células humanas para programas de descoberta de drogas fenotípicas (PDD). Embora esses novos dispositivos pudessem prever a segurança e a eficácia de drogas experimentais em humanos com mais precisão, seu desenvolvimento para a clínica ainda depende fortemente de dados de mamíferos, notadamente o uso de modelos de doenças em camundongos. Em paralelo aos modelos de doenças organoides ou organ-on-chip humanas, o desenvolvimento de modelos relevantes em camundongos in vitro é, portanto, uma necessidade não atendida para avaliar comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre espécies e condições in vivo e in vitro. Neste artigo, descreve-se um ensaio de brotamento vascular que utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários (EBs). EBs vascularizadas cultivadas em gel de colágeno 3D desenvolvem novos vasos sanguíneos que se expandem, um processo chamado angiogênese brotamento. Esse modelo recapitula as principais características da angiogênese germinada in vivo-formação de vasos sanguíneos a partir de uma rede vascular pré-existente, incluindo seleção de células da ponta endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação celular, formação de tubos e recrutamento de células murais. É passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese e apresenta semelhanças com ensaios vasculares tridimensionais (3D) recentemente descritos baseados em tecnologias humanas de iPSC.
Introduction
Nas últimas três décadas, a descoberta de fármacos baseada em alvos (TDD) tem sido amplamente empregada na descoberta de fármacos pela indústria farmacêutica. A TDD incorpora um alvo molecular definido que desempenha um papel importante em uma doença e depende do desenvolvimento de sistemas de cultura celular relativamente simples e leituras para triagem de drogas1. A maioria dos modelos típicos de doenças usados em programas de TDD incluem métodos tradicionais de cultura de células, como células cancerosas ou linhagens celulares imortalizadas cultivadas em ambientes artificiais e substratos não fisiológicos. Embora muitos desses modelos tenham fornecido ferramentas viáveis para identificar candidatos a fármacos bem-sucedidos, o uso de tais sistemas pode ser questionável devido à sua baixa relevância para a doença2.
Para a maioria das doenças, os mecanismos subjacentes são realmente complexos e vários tipos celulares, vias de sinalização independentes e múltiplos conjuntos de genes são frequentemente encontrados para contribuir para um fenótipo específico da doença. Isso também é verdade para doenças hereditárias em que a causa primária é uma mutação em um único gene. Com o recente advento de tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) e ferramentas de edição gênica, agora é possível gerar organoides 3D e modelos de doenças organ-on-chip que poderiam recapitular melhor a complexidade humana in vivo 3,4. O desenvolvimento de tais tecnologias está associado ao ressurgimento do interesse em programas de descoberta de drogas fenotípicas (TID)1. O TID pode ser comparado ao rastreamento empírico, pois não depende do conhecimento da identidade de um alvo específico da droga ou de uma hipótese sobre seu papel na doença. A abordagem TID é hoje cada vez mais reconhecida por contribuir fortemente para a descoberta de drogas de primeira classe5. Como o desenvolvimento de tecnologias de organoides humanos e organ-on-chip ainda está engatinhando, espera-se que os modelos iPSC (complementados com ferramentas inovadoras de imagem e aprendizado de máquina6,7) forneçam, em um futuro próximo, vários novos modelos complexos de doenças baseadas em células para triagem de drogas e programas associados de TID para superar a baixa produtividade da abordagem TDD8, 9º.
Embora os modelos organoides humanos e organ-on-chip possam fornecer informações importantes sobre a complexidade da doença e para a identificação de novos medicamentos, trazer medicamentos para a nova prática clínica também depende fortemente de dados de modelos animais para avaliar sua eficácia e segurança. Entre eles, camundongos geneticamente modificados são certamente os modelos de mamíferos preferidos. Eles têm muitas vantagens, pois têm um tempo de geração relativamente curto para os mamíferos, têm muitos fenótipos semelhantes às doenças humanas e podem ser facilmente manipulados geneticamente. São, portanto, extensivamente utilizados em programas de descoberta de fármacos10. No entanto, fazer a ponte entre camundongos e humanos continua sendo um desafio importante11. O desenvolvimento de modelos in vitro de camundongos equivalentes a modelos organoides e organ-on-chip humanos poderia, pelo menos parcialmente, preencher essa lacuna, pois permitirá comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre dados in vivo de camundongos e in vitro em humanos.
Aqui, um ensaio de brotamento vascular em corpos embrionários (EBs) de camundongos é descrito. Os vasos sanguíneos são compostos por células endoteliais (revestimento interno das paredes dos vasos), células murais (células musculares lisas vasculares e pericitos)12. Esse protocolo baseia-se na diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em EBs vascularizadas utilizando gotículas pendentes que recapitulam a diferenciação de células endoteliais e murais de novo 13,14. CTEs de camundongos podem ser facilmente estabelecidas em cultura a partir de blastocistos isolados do dia 3,5 de camundongos com diferentes origens genéticas15. Também oferecem possibilidades de análise clonal, rastreamento de linhagens e podem ser facilmente manipulados geneticamente para gerar modelos de doenças13,16.
Como os vasos sanguíneos nutrem todos os órgãos, não é surpreendente que muitas doenças, se não todas, estejam associadas a alterações na microvasculatura. Em condições patológicas, as células endoteliais podem adotar um estado ativado ou podem se tornar disfuncionais, resultando em morte celular mural ou migração para longe dos vasos sanguíneos. Estes podem resultar em angiogênese excessiva ou em rarefação de vasos, podem induzir fluxo sanguíneo anormal e barreira vascular defeituosa levando ao extravasamento de células imunes e inflamação12,17,18,19. A pesquisa para o desenvolvimento de fármacos moduladores dos vasos sanguíneos é, portanto, alta, e múltiplos atores e conceitos moleculares já foram identificados para o direcionamento terapêutico. Nesse contexto, o protocolo descrito é particularmente adequado para a construção de modelos de doenças e para testes de drogas, pois recapitula as principais características da angiogênese em brotamento in vivo, incluindo seleção de células da ponta e do pedúnculo endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação de células endoteliais, formação de tubos e recrutamento de células murais. Também apresenta semelhanças com ensaios vasculares 3D recentemente descritos, baseados em tecnologias humanas iPSC20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um ensaio vascular de brotamento baseado em EB 3D imparcial, robusto e reprodutível, passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese. Este método oferece vantagens sobre muitos ensaios bidimensionais (2D) amplamente utilizados usando culturas de células endoteliais, como as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) para monitorar a migração (ensaio de scratch lateral ou o ensaio da câmara de Boyden)22,23 ou proliferação (contagem do número de células, de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND, e pela Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Milipore, Merck | 805740 | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| Agar Noble | Difco, BD Pharmigen | 214220 | |
| Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG | Life technologies | A21434 | |
| APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3) | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone R35-95) | BD Biosciences | 553932 | |
| Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope | ZEISS | ||
| Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF) | Peprotech | 450-33 | |
| Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line) | Telstar | 133H401001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm | Marienfeld | 640211 | |
| Cell culture dishes 60 x 15mm | Corning | 353802 | |
| Cell culture dishes, 35 x 10 mm | Corning | 353801 | |
| Cell culture plates 12-well | Corning | 3512 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 1855196 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| CHIR-99021 (CT99021) HCl | Selleckchem | S2924 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg | Corning | 354249 | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5 | Leica | ||
| Cover glasses, 24 × 50 mm | Vwr | 631-0146 | |
| DAPT γ‑secretase inhibitor | Sigma Aldrich | D5942 | |
| DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone | BioXcell | BP0060 | |
| DC101 isotype rat IgG1 | BioXcell | BP0290 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438-5X | Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling |
| DPBS (10x), no calcium, no magnesium | Gibco, Thermofisher scientific | 14200067 | |
| EDTA 40 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 15575-038 | |
| Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum | Gibco, Thermofisher scientific | 16141-079 | Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year |
| Eppendorf Microcentrifuge 5415R | Eppendorf AG | Z605212 | |
| Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL) | Roche | 11120166001 | |
| ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units 1 mL) | Milipore, Merck | ESG1107 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Falcon tubes 50 mL | Greiner Bio-0ne | 227270 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200 | Greiner Bio-One | 739288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10 | Greiner Bio-One | 771288 | |
| Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000 | Greiner Bio-One | 740288 | |
| FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4) | Sigma Aldrich | F3777 | |
| FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103107 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530) | Biolegend | 400605 | |
| Fluorscent mounting media | DAKO | S3023 | |
| Gascompress | Cutisoft | 45846 | |
| Gauze Cutisoft 10 x 10 cm | Bsn Medical | 45844_00 | |
| Gel blotting paper, Grade GB003 | Whatman | WHA10547922 | |
| Gelatin solution, type B | Sigma-Aldrich | G1393-100 ml | |
| Glasgow's MEM (GMEM) | Gibco, Thermofisher scientific | 21710082 | |
| IHC Zinc Fixative | BD Pharmigen | 550523 | |
| IncuSafe CO2 Incubator | PHCBi | MCO-170AICUV-PE | |
| Interleukin-6, human (hIL-6) | Roche | 11138600001 | |
| L-Glutamine 200 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco, Thermofisher scientific | 11140035 | |
| Microscope slide box | Kartell Labware | 278 | |
| Microscope slide, Starfrost | Knittel glass | VS113711FKB.0 | |
| Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00110467 | |
| Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00148981 | |
| Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00093576 | |
| Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00154014 | |
| Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00096292 | |
| Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00099064 | |
| Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT01658692 | |
| Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00097020 | |
| Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT00156982 | |
| Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00153104 | |
| Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer | Qiagen | QT01052044 | |
| Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay | Qiagen | QT00114576 | |
| Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts (2 M) | Gibco, Thermofisher scientific | A24903 | Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely |
| Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033) | ATCC | SCRC-1033 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)]. |
| Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+ | Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)]. | ||
| Mouse embryonic stem cells line E14 | Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001). | ||
| Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011) | ATCC | SCRC-1011 | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)]. |
| Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola) | Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)]. | ||
| NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-1000 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PDGF-BB, Recombinant Human | Peprotech | 100-14B | |
| Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse | BD Biosciences | 550274 | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco, Thermofisher scientific | 15140122 | |
| Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile | Greiner Bio-One | 633181 | |
| Pipetboy acu 2 | Integra-Biosciences | 155 019 | |
| Pipetman G Multichannel P8 x 200G | Gilson | F144072 | |
| Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G | Gilson | F167360 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP | |
| RNeasy Plus mini Kit | QIAGEN | 74134 | |
| Serological pipettes, 10 mL | Greiner Bio-One | 607 180 | |
| Serological pipettes, 25 mL | Greiner Bio-One | 760 180 | |
| Serological pipettes, 5 mL | Greiner Bio-One | 606 180 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Merck | 106498 | |
| Sodium pyruvate 100 mM | Gibco, Thermofisher scientific | 11360039 | |
| Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| Thermal cycler, T100 | Biorad | 1861096 | |
| Triton X-100 (BioXtra) | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco, Thermofisher scientific | 15250061 | |
| Trypsin (2.5%) | Gibco, Thermofisher scientific | 15090046 | |
| Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL | Corning | 430758 | |
| VEGFA165 , recombinant murine | Peprotech | 450-32 | |
| Water, Sterile | Fresenius-Kabi | B230531 | |
| Waterbath, Lab-Line Digital | Thermo Fischer Scientific | 18052A |
Riferimenti
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