Pre-chiasmatisk, enkelt injektion af autologt blod for at inducere eksperimentel subaraknoid blødning i en rottemodel

Summary

Subarachnoid blødning fortsætter med at bære en høj byrde af dødelighed og sygelighed hos mennesket. For at lette yderligere forskning i tilstanden og dens patofysiologi præsenteres en præ-chiasmatisk, enkelt injektionsmodel.

Abstract

På trods af fremskridt i behandlingen i løbet af de sidste årtier bærer subaraknoid blødning (SAH) fortsat en høj byrde af sygelighed og dødelighed, der stort set rammer en ret ung befolkning. Flere dyremodeller af SAH er blevet udviklet til at undersøge de patofysiologiske mekanismer bag SAH og til at teste farmakologiske interventioner. Den præ-chiasmatiske, enkelt injektionsmodel i rotten, der præsenteres i denne artikel, er en eksperimentel model af SAH med et forudbestemt blodvolumen. Kort sagt bedøves dyret, intuberes og holdes under mekanisk ventilation. Temperaturen reguleres med en varmepude. Et kateter placeres i halearterien, hvilket muliggør kontinuerlig blodtryksmåling samt blodprøvetagning. Atlantooccipitalmembranen skæres, og et kateter til trykoptagelse placeres i cisterna magna for at muliggøre intracerebral trykmåling. Dette kateter kan også bruges til intratekale terapeutiske indgreb. Rotten placeres i en stereotaksisk ramme, et burrhul bores anteriort til bregmaen, og et kateter indsættes gennem burrhullet og placeres lige foran den optiske chiasme. Autologt blod (0,3 ml) trækkes ud af halekateteret og injiceres manuelt. Dette resulterer i en stigning i intracerebralt tryk og et fald i cerebral blodgennemstrømning. Dyret holdes bedøvet i 30 minutter og gives subkutan saltvand og smertestillende midler. Dyret ekstuberes og returneres til sit bur. Den præchiasmatiske model har en høj reproducerbarhedshastighed og begrænset variation mellem dyr på grund af det forudbestemte blodvolumen. Det efterligner SAH hos mennesker, hvilket gør det til en relevant model for SAH-forskning.

Introduction

Ikke-traumatisk subaraknoid blødning (SAH) er en form for slagtilfælde, der repræsenterer omkring 5% af alle tilfælde. Den mest almindelige årsag til ikke-traumatisk SAH er den pludselige brud på en aneurisme (aSAH), som tegner sig for 85% af SAH’erne. Andre årsager omfatter brud på en arterio-venøs misdannelse, koagulopatier og brud på vener i perimesencephalic blødning¹. Incidensraten er 9 pr. 100.000 personår med dødelighed omkring en ud af tre og en anden tredjedel, der kræver støtte fra dagligdagen efter SAH ^2,3.

Efter indledende stabilisering og diagnosebekræftelse afhænger behandlingen af blødningens sværhedsgrad. De hårdest ramte patienter vil få indsat et ekstraventrikulært dræn i ventriklerne for at reducere det intracerebrale tryk (ICP) og blive indlagt på neurointensivafdelingen, hvor de overvåges nøje. Patienterne vil gennemgå en angiografi for at identificere den (sandsynlige) aneurisme og derefter få aneurismet oprullet eller klippet for at forhindre genblødning⁴. På trods af adskillige forsøg med farmakologiske terapier har kun nimodipin, en calciumkanalantagonist, vist sig at forbedre resultaterne⁵. Flere kliniske forsøg er i øjeblikket i gang. Se anmeldelsen af Daou og kolleger for en omfattende liste⁶.

Bruddet af en aneurisme er blevet beskrevet som den pludselige indtræden af den værste hovedpine, der nogensinde er oplevet, eller en tordenklaphovedpine. Bruddet resulterer i en kraftig stigning i ICP efterfulgt af en reduktion i cerebral blodgennemstrømning (CBF). Denne reduktion resulterer i global iskæmi i hjernen, hvilket kan resultere i bevidsthedstab. Denne mere mekanistiske vej sammen med den initierede nedbrydning af de ekstravaserede elementer i blodet giver anledning til cytokinfrigivelse og aktivering af det medfødte immunsystem, hvilket resulterer i steril neuroinflammation. Desuden observeres ofte nedbrydning af blod-hjerne-barrieren, hvilket resulterer i cerebralt ødem og forstyrrelse i ionhomeostasen. Alle disse ændringer og mere, opfundet tidlig hjerneskade (EBI), forekommer inden for de første par dage og resulterer i neuronalt tab og apoptose⁷.

Ca. 1/3 af patienterne ramt af aSAH vil udvikle forsinket cerebral iskæmi (DCI) mellem dag 4-14⁸. DCI defineres som enten debut af en fokal, neurologisk svækkelse eller et fald på mindst to point på Glasgow komaskalaen, der varer i mindst 1 time, når andre årsager, herunder anfald og genblødning, er udelukket. DCI er forbundet med en øget risiko for død og nedsat funktionsresultat efter aSAH⁹. Cerebral vasospasme (CVS), indsnævring af cerebrale arterier, har været kendt for at være forbundet med DCI i årtier og blev tidligere anset for at være den eneste årsag til DCI. Det er siden blevet vist, at CVS kan forekomme uden udvikling af DCI, og flere faktorer, herunder mikrovaskulær trombose og indsnævring, kortikal spredningsdepression og et inflammatorisk respons af EBI er siden blevet identificeret^10,11,12.

På grund af EBI’s og DCI’s store indflydelse på sygdomsforløbet og udfaldet af de ramte patienter, skal dyremodeller efterligne disse i videst muligt omfang, samtidig med at de stadig er reproducerbare. Forskere har anvendt en bred vifte af forskellige modeller i en række dyr fra mus til ikke-menneskelige primater for at forsøge at simulere aSAH. Sprague-Dawley og Wistar vildtype rotter er i øjeblikket de mest almindeligt anvendte forsøgsdyr, og de mest almindelige modeller er den endovaskulære perforeringsmodel, cisterna-magna dobbeltinjektionsmodellen og endelig den præ-chiasmatiske enkeltinjektionsmodel, som vil blive beskrevet i denne artikel¹³.

Den præ-chiasmatiske, enkeltinjektionsmodel blev oprindeligt udviklet af Prunell og kolleger for at imødegå nogle af manglerne ved de andre eksperimentelle modeller¹⁴. Når operationen mestres, er den meget reproducerbar og minimerer variation mellem dyr. Modellen efterligner SAH hos mennesker på flere punkter, herunder den pludselige stigning i ICP efter injektion af blod, hvilket resulterer i forbigående global iskæmi på grund af et fald i CBF^15,16. Det påvirker den forreste cirkulation, hvor de fleste aSAH hos mennesker forekommer¹⁷. Dødeligheden varierer fra 10% -33% afhængigt af undersøgelsen og mængden af injiceret blod^14,18. Forsinket celledød og neuroinflammation kan påvises på dag 2 og 7, hvorved der tilvejebringes variabler til undersøgelse af konsekvenserne af EBI og DCI ^19,20.

Studiet præsenterer en opdateret beskrivelse af den præchiasmatiske enkeltinjektionsmodel hos rotter sammen med en beskrivelse af, hvordan ICP-sonden kan udnyttes som port til intratekal administration af lægemidler.

Protocol

Denne procedure udføres i overensstemmelse med EU’s direktiv 2010/63/EU om beskyttelse af dyr, der anvendes til videnskabelige formål og er godkendt af Dyreforsøgstilsynet (licens nr. 2016-15-0201-00940). Kirurgi udføres ved hjælp af aseptisk teknik i videst muligt omfang, herunder sterile instrumenter, handsker, katetre og suturer. Undersøgelsen anvendte han- og hunrotter fra Sprague-Dawley, der vejede 230-350 g, grupperet i 12-timers lys/mørk cyklus med konstant temperatur på 22 °C (± 2 °C) og fugtighed på …

Representative Results

Kvinder har en øget risiko for aSAH sammenlignet med mænd. På trods af dette anvendes mandlige gnavere primært i forsøg på grund af mulig bias fra heterogenitet af østruscyklus hos kvinder. De repræsentative resultater, der præsenteres her, er fra en nylig publikation, der sammenligner hun- og hanrotter, hvilket bekræfter, at modellen giver lignende resultater hos hundyr sammenlignet med hanrotterpå 21 år. Undersøgelsen omfattede 34 hunrotter fra Sprague-Dawley (18 SAH’er og 16 shams)…

Discussion

Den præchiasmatiske enkeltinjektionsmodel af SAH efterligner flere vigtige elementer i human SAH, herunder stigningen i ICP, reduktion af CBF, forbigående global iskæmi, opregulering af neuroinflammatoriske markører og CVS ^{14,15,16,18,19,20}. ICP-sonden blev også anvendt som port til intratekal administration (<strong cla…

Materials

16 G peripheral vein catheter	BD Venflon	393229	Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed
Anesthesia bell/ chamber	Unknown
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL80
Blood pressure (BP) monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Curved forceps, 12 cm x 3	F.S.T	11001-12	For anesthesia
Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm	Homemade		Made from surgical towels
Data acquisition hardware	Adinstruments	ML870 Powerlab
Data acquistion software	Adinstruments	LabChart 6.0
Drill	KMD	1189
Drill controller	Silfradent	300 IN
Flexible light	Schott	KL200
Heating pad	Minco	1135
Hypodermic needle, 20 G	KD Medical	301300	Connects to stereotaxic frame
ICP monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	TEC3
Laptop	Lenovo	T410
Laser doppler monitor	Adinstruments	ML191
Laser doppler probe	Oxford Optronics	MSF100XP	Connects to laser doppler monitor
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13	For anesthesia
Precision syringe, 0.025 mL	Hamilton	547407
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	M900
Surgical microscope	Carl Zeiss	F170
Suture needle	Allgaier	1245	For anesthesia
Temperaure controller	CWE,INC.	TC-1000
Transducer x 2	Adinstruments	MLT0699	Connects to BP and ICP monitor
Ventilator	Ugo Basile	7025
Veterinary clipper	Aesculap	GT421
3-pronged Blair retractor, 13.5 cm	Agnthos	17022–13
Blunt Alm retractor	F.S.T	17008-07
Curved forceps, 12 cm x 2	F.S.T	11001-12
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13
Straight Dumont forceps, 11 cm	F.S.T	11252-00
Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2	F.S.T	13008-12
Straight Iris scissor, 9 cm	F.S.T	14090-09
Straight Vannas scissor, 10.5 cm	F.S.T	15018-10
Absorpable swabs	Kettenbach	31603
Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm	Vömel	14757
Bone wax	Aesculap	1029754
Carbomer eye gel 2 mg/g	Paranova
Cotton swab	Heinz Herenz	WA-1
Cotton tipped applicator x 4	Selefa	120788
Hypodermic needle, 23 G x2	KD Medical	900284	Connects to stopcock. Remove distal end
Hypodermic needle, 23 G x3	KD Medical	900284	Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe
ICP probe:	Homemade		Made of the following:
Polythene tubing, 20 mm	Smiths medical	800/100/200	Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm.
Silicone tubing, 10 mm	Fisher	15202710	ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm.
Silicone tubing, 2 mm	Fisher	11716513	ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm.
Micro hematocrit tubes	Brand	7493 11
OP-towel, 45 cm x75 cm	Mölnlycke	800430
PinPort adapter, 22 G	Instech	PNP3F22
PinPort injector	Instech	PNP3M
Polythene tubing, 2 x 20 cm	Smiths medical	800/100/200	Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm.
Rubberband	Unknown
Scalpel, 10 blade	Kiato	23110
Spinalneedle, 25 G x 3.5''	Braun	5405905-01
Stopcock system, Discofix x 2	Braun	16494C	Connects to transducer
Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3	Ethicon	EH7145H
Syringe, 1 mL	BD Plastipak	1710023
Syringe, luer-lock, 10 mL x 4	BD Plastipak	305959	Connects to transducer
Tissue adhesive glue	3M	1469SB
0.5% Chlorhexidine spirit	Faaborg Pharma	210918
Carprofen 50 mg/mL	ScanVet	43715	Diluted 1:10
Isoflurane	Baxter
Isotonic saline	Amgros	16404
Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL	Amgros	16318