Injection unique pré-chiasmatique de sang autologue pour induire une hémorragie sous-arachnoïdienne expérimentale chez un rat

Summary

L’hémorragie sous-arachnoïdienne continue de porter un lourd fardeau de mortalité et de morbidité chez l’homme. Pour faciliter la poursuite des recherches sur la maladie et sa physiopathologie, un modèle pré-chiasmatique à injection unique est présenté.

Abstract

Malgré les progrès réalisés dans le traitement au cours des dernières décennies, l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) continue de porter un lourd fardeau de morbidité et de mortalité, touchant en grande partie une population assez jeune. Plusieurs modèles animaux d’HSA ont été développés pour étudier les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’HSA et tester des interventions pharmacologiques. Le modèle pré-chiasmatique à injection unique chez le rat présenté dans cet article est un modèle expérimental d’HSA avec un volume sanguin prédéterminé. Brièvement, l’animal est anesthésié, intubé et maintenu sous ventilation mécanique. La température est régulée avec un coussin chauffant. Un cathéter est placé dans l’artère de la queue, permettant une mesure continue de la pression artérielle ainsi que des prélèvements sanguins. La membrane atlanto-occipitale est incisée et un cathéter pour l’enregistrement de la pression est placé dans la citerne magna pour permettre la mesure de la pression intracérébrale. Ce cathéter peut également être utilisé pour des interventions thérapeutiques intrathécales. Le rat est placé dans un cadre stéréotaxique, un trou de bavure est percé antérieurement au bregma, et un cathéter est inséré à travers le trou de bavure et placé juste avant le chiasme optique. Le sang autologue (0,3 mL) est prélevé du cathéter de queue et injecté manuellement. Il en résulte une augmentation de la pression intracérébrale et une diminution du flux sanguin cérébral. L’animal est maintenu sous sédation pendant 30 minutes et reçoit une solution saline sous-cutanée et des analgésiques. L’animal est extubé et retourné dans sa cage. Le modèle pré-chiasmatique a un taux de reproductibilité élevé et une variation limitée entre les animaux en raison du volume sanguin prédéterminé. Il imite l’HSA chez l’homme, ce qui en fait un modèle pertinent pour la recherche sur les SEP.

Introduction

L’hémorragie sous-arachnoïdienne non traumatique (HSA) est une forme d’AVC, représentant environ 5% de tous les cas. La cause la plus fréquente d’HSA non traumatique est la rupture soudaine d’un anévrisme (HSAa), qui représente 85% des HSA. D’autres causes incluent la rupture d’une malformation artério-veineuse, des coagulopathies et la rupture des veines dans l’hémorragie périmésencéphale¹. Le taux d’incidence est de 9 pour 100 000 années-personnes avec une mortalité d’environ une sur trois et un autre tiers nécessitant le soutien de la vie quotidienne après l’HSA ^2,3.

Après la stabilisation initiale et la confirmation du diagnostic, le traitement dépend de la gravité de l’hémorragie. Les patients les plus sévèrement atteints auront un drain extra-ventriculaire inséré dans les ventricules pour réduire la pression intracérébrale (PIC) et seront admis à l’unité de soins neurointensifs, où ils seront étroitement surveillés. Les patients subiront une angiographie pour identifier l’anévrisme (probable) et ensuite auront l’anévrisme enroulé ou coupé pour éviter une récidive hémorragique⁴. Malgré de nombreux essais de thérapies pharmacologiques, seule la nimodipine, un antagoniste des canaux calciques, a montré qu’elle améliorait les résultats⁵. Plusieurs essais cliniques sont actuellement en cours. Veuillez consulter l’examen par Daou et ses collègues pour une liste complète⁶.

La rupture d’un anévrisme a été décrite comme l’apparition soudaine du pire mal de tête jamais connu ou d’un coup de tonnerre. La rupture entraîne une forte augmentation de l’ICP suivie d’une réduction du débit sanguin cérébral (CBF). Cette réduction entraîne une ischémie globale du cerveau, ce qui peut entraîner une perte de conscience. Cette voie plus mécaniste, ainsi que la dégradation initiée des éléments extravasés du sang, donne lieu à la libération de cytokines et à l’activation du système immunitaire inné, ce qui entraîne une neuroinflammation stérile. En outre, une dégradation de la barrière hémato-encéphalique, entraînant un œdème cérébral et une perturbation de l’homéostasie ionique, est souvent observée. Tous ces changements et plus encore, appelés lésions cérébrales précoces (EBI), se produisent dans les deux premiers jours et entraînent une perte neuronale et une apoptose⁷.

Environ 1/3 des patients atteints d’HSAa développeront une ischémie cérébrale retardée (ICD) entre le 4e et le 14e jour⁸. L’ICD est définie comme le début d’une déficience neurologique focale ou une chute d’au moins deux points sur l’échelle de coma de Glasgow pendant au moins 1 h, lorsque d’autres causes, y compris les convulsions et les saignements répétés, sont exclues. L’ICD est associée à un risque accru de décès et à une diminution des résultats fonctionnels après l’HSAa⁹. Le vasospasme cérébral (CVS), le rétrécissement des artères cérébrales, est connu pour être associé à l’ICD depuis des décennies et était autrefois considéré comme la seule raison de l’ICD. Il a depuis été démontré que le SVC peut se produire sans le développement d’ICD et d’autres facteurs, y compris la thrombose et la constriction microvasculaires, la dépression de propagation corticale et une réponse inflammatoire de l’EBI ont depuis été identifiés^10,11,12.

En raison de la grande influence de l’EBI et du DCI sur l’évolution de la maladie et l’issue des patients atteints, les modèles animaux doivent les imiter dans la plus grande mesure possible, tout en restant reproductibles. Les chercheurs ont utilisé un large éventail de modèles différents chez une variété d’animaux, des souris aux primates non humains, pour essayer de simuler l’HSA. Les rats sauvages Sprague-Dawley et Wistar sont actuellement les animaux de laboratoire les plus couramment utilisés, et les modèles les plus courants sont le modèle de perforation endovasculaire, le modèle de double injection citerne-magna, et enfin le modèle pré-chiasmatique à injection unique, qui sera décrit dans cet article¹³.

Le modèle pré-chiasmatique à injection unique a été développé à l’origine par Prunell et ses collègues pour remédier à certaines des lacunes des autres modèles expérimentaux¹⁴. La chirurgie, lorsqu’elle est maîtrisée, est hautement reproductible et minimise les variations entre les animaux. Le modèle imite l’HSA chez l’homme sur plusieurs points, y compris l’augmentation soudaine de la PIC suite à l’injection de sang, entraînant une ischémie globale transitoire due à une chute du CBF^15,16. Il affecte la circulation antérieure, qui est l’endroit où la plupart des HSA chez l’homme se produisent¹⁷. La mortalité varie de 10% à 33% selon l’étude et la quantité de sang injectée^14,18. La mort cellulaire retardée et la neuroinflammation peuvent être détectées les jours 2 et 7, fournissant ainsi des variables pour étudier les conséquences de l’EBI et de l’ICD^19,20.

L’étude présente une description mise à jour du modèle d’injection unique pré-chiasmatique chez le rat ainsi qu’une description de la façon d’utiliser la sonde ICP comme port pour l’administration intrathécale de produits pharmaceutiques.

Protocol

Cette procédure est effectuée conformément à la directive 2010/63/UE de l’Union européenne concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et approuvée par l’Inspection danoise de l’expérimentation animale (licence n° 2016-15-0201-00940). La chirurgie est réalisée en utilisant la technique aseptique dans la mesure du possible, y compris des instruments stériles, des gants, des cathéters et des sutures. L’étude a utilisé des rats Sprague-Dawley mâles et femelles pesant de 23…

Representative Results

Les femmes ont un risque accru d’HSAA par rapport aux hommes. Malgré cela, les rongeurs mâles sont principalement utilisés dans les expériences en raison du biais possible de l’hétérogénéité du cycle de l’oestrus chez les femelles. Les résultats représentatifs présentés ici proviennent d’une publication récente comparant les rats femelles et mâles, confirmant que le modèle produit des résultats similaires chez les animaux femelles par rapport aux rats mâles21. L’étude …

Discussion

Le modèle pré-chiasmatique à injection unique de SAH imite plusieurs éléments importants de l’HSA humain, y compris le pic de la PIC, la réduction de la CBF, l’ischémie globale transitoire, la régulation positive des marqueurs neuroinflammatoires et CVS ^{14,15,16,18,19,20}. La sonde ICP a également été utilisée …

Materials

16 G peripheral vein catheter	BD Venflon	393229	Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed
Anesthesia bell/ chamber	Unknown
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL80
Blood pressure (BP) monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Curved forceps, 12 cm x 3	F.S.T	11001-12	For anesthesia
Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm	Homemade		Made from surgical towels
Data acquisition hardware	Adinstruments	ML870 Powerlab
Data acquistion software	Adinstruments	LabChart 6.0
Drill	KMD	1189
Drill controller	Silfradent	300 IN
Flexible light	Schott	KL200
Heating pad	Minco	1135
Hypodermic needle, 20 G	KD Medical	301300	Connects to stereotaxic frame
ICP monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	TEC3
Laptop	Lenovo	T410
Laser doppler monitor	Adinstruments	ML191
Laser doppler probe	Oxford Optronics	MSF100XP	Connects to laser doppler monitor
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13	For anesthesia
Precision syringe, 0.025 mL	Hamilton	547407
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	M900
Surgical microscope	Carl Zeiss	F170
Suture needle	Allgaier	1245	For anesthesia
Temperaure controller	CWE,INC.	TC-1000
Transducer x 2	Adinstruments	MLT0699	Connects to BP and ICP monitor
Ventilator	Ugo Basile	7025
Veterinary clipper	Aesculap	GT421
3-pronged Blair retractor, 13.5 cm	Agnthos	17022–13
Blunt Alm retractor	F.S.T	17008-07
Curved forceps, 12 cm x 2	F.S.T	11001-12
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13
Straight Dumont forceps, 11 cm	F.S.T	11252-00
Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2	F.S.T	13008-12
Straight Iris scissor, 9 cm	F.S.T	14090-09
Straight Vannas scissor, 10.5 cm	F.S.T	15018-10
Absorpable swabs	Kettenbach	31603
Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm	Vömel	14757
Bone wax	Aesculap	1029754
Carbomer eye gel 2 mg/g	Paranova
Cotton swab	Heinz Herenz	WA-1
Cotton tipped applicator x 4	Selefa	120788
Hypodermic needle, 23 G x2	KD Medical	900284	Connects to stopcock. Remove distal end
Hypodermic needle, 23 G x3	KD Medical	900284	Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe
ICP probe:	Homemade		Made of the following:
Polythene tubing, 20 mm	Smiths medical	800/100/200	Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm.
Silicone tubing, 10 mm	Fisher	15202710	ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm.
Silicone tubing, 2 mm	Fisher	11716513	ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm.
Micro hematocrit tubes	Brand	7493 11
OP-towel, 45 cm x75 cm	Mölnlycke	800430
PinPort adapter, 22 G	Instech	PNP3F22
PinPort injector	Instech	PNP3M
Polythene tubing, 2 x 20 cm	Smiths medical	800/100/200	Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm.
Rubberband	Unknown
Scalpel, 10 blade	Kiato	23110
Spinalneedle, 25 G x 3.5''	Braun	5405905-01
Stopcock system, Discofix x 2	Braun	16494C	Connects to transducer
Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3	Ethicon	EH7145H
Syringe, 1 mL	BD Plastipak	1710023
Syringe, luer-lock, 10 mL x 4	BD Plastipak	305959	Connects to transducer
Tissue adhesive glue	3M	1469SB
0.5% Chlorhexidine spirit	Faaborg Pharma	210918
Carprofen 50 mg/mL	ScanVet	43715	Diluted 1:10
Isoflurane	Baxter
Isotonic saline	Amgros	16404
Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL	Amgros	16318