Prächiasmatische, einmalige Injektion von Eigenblut zur Induktion einer experimentellen Subarachnoidalblutung in einem Rattenmodell

Summary

Die Subarachnoidalblutung birgt nach wie vor eine hohe Belastung durch Mortalität und Morbidität beim Menschen. Um die weitere Erforschung der Erkrankung und ihrer Pathophysiologie zu erleichtern, wird ein prächiasmatisches Einzelinjektionsmodell vorgestellt.

Abstract

Trotz Fortschritten in der Behandlung in den letzten Jahrzehnten ist die Subarachnoidalblutung (SAB) nach wie vor mit einer hohen Morbiditäts- und Mortalitätsbelastung verbunden, von der vor allem eine relativ junge Bevölkerung betroffen ist. Es wurden mehrere Tiermodelle der SAB entwickelt, um die pathophysiologischen Mechanismen hinter SAB zu untersuchen und pharmakologische Interventionen zu testen. Das in diesem Artikel vorgestellte prächiasmatische Einzelinjektionsmodell bei der Ratte ist ein experimentelles Modell der SAB mit einem vorgegebenen Blutvolumen. Kurz wird das Tier betäubt, intubiert und mechanisch beatmet. Die Temperatur wird mit einem Heizkissen reguliert. In der Schwanzarterie wird ein Katheter gelegt, der eine kontinuierliche Blutdruckmessung sowie eine Blutentnahme ermöglicht. Die atlantooccipitale Membran wird eingeschnitten und ein Katheter zur Druckaufzeichnung in die Cisterna magna gelegt, um eine intrazerebrale Druckmessung zu ermöglichen. Dieser Katheter kann auch für intrathekale therapeutische Eingriffe verwendet werden. Die Ratte wird in einen stereotaktischen Rahmen gelegt, ein Bohrloch wird vor dem Bregma gebohrt und ein Katheter wird durch das Bohrloch eingeführt und direkt vor dem optischen Chiasma platziert. Eigenblut (0,3 ml) wird aus dem Schwanzkatheter entnommen und manuell injiziert. Dies führt zu einem Anstieg des intrazerebralen Drucks und einer Abnahme des zerebralen Blutflusses. Das Tier wird 30 Minuten lang sediert gehalten und erhält subkutane Kochsalzlösung und Analgetika. Das Tier wird extubiert und in seinen Käfig zurückgebracht. Das prächiasmatische Modell weist eine hohe Reproduzierbarkeitsrate und eine begrenzte Variation zwischen den Tieren aufgrund des vorgegebenen Blutvolumens auf. Es ahmt SAB beim Menschen nach und ist damit ein relevantes Modell für die SAH-Forschung.

Introduction

Die nicht-traumatische Subarachnoidalblutung (SAB) ist eine Form des Schlaganfalls, die etwa 5 % aller Fälle ausmacht. Die häufigste Ursache für eine nicht-traumatische SAB ist die plötzliche Ruptur eines Aneurysmas (aSAH), die 85 % der SAB ausmacht. Weitere Ursachen sind die Ruptur einer arterio-venösen Malformation, Gerinnungsstörungen und Venenrupturen bei perimesenzephaler Blutung¹. Die Inzidenzrate liegt bei 9 pro 100.000 Personenjahre, wobei die Sterblichkeit nach SAB ^2,3 etwa jeder Dritte und ein weiteres Drittel die Unterstützung des täglichen Lebens erfordert.

Nach initialer Stabilisierung und Diagnosebestätigung richtet sich die Behandlung nach dem Schweregrad der Blutung. Den am schwersten betroffenen Patienten wird eine extraventrikuläre Drainage in die Ventrikel gelegt, um den intrazerebralen Druck (ICP) zu senken, und sie werden auf die Neurointensivstation aufgenommen, wo sie engmaschig überwacht werden. Die Patienten werden einer Angiographie unterzogen, um das (wahrscheinliche) Aneurysma zu identifizieren, und anschließend wird das Aneurysma gewickelt oder abgeschnitten, um eine erneute Blutung zu verhindern⁴. Trotz zahlreicher Studien zu pharmakologischen Therapien hat sich gezeigt, dass nur Nimodipin, ein Kalziumkanal-Antagonist, die Ergebnisse verbessert⁵. Derzeit laufen mehrere klinische Studien. Eine ausführliche Liste finden Sie in der Rezension von Daou und Kollegen⁶.

Die Ruptur eines Aneurysmas wurde als plötzliches Auftreten der schlimmsten Kopfschmerzen beschrieben, die jemals erlebt wurden, oder als Donnerschlagkopf. Die Ruptur führt zu einem steilen Anstieg des ICP, gefolgt von einer Verringerung des zerebralen Blutflusses (CBF). Diese Verminderung führt zu einer globalen Ischämie des Gehirns, die zu einem Bewusstseinsverlust führen kann. Dieser eher mechanistische Weg führt zusammen mit dem initiierten Abbau der extravasierten Elemente des Blutes zur Freisetzung von Zytokinen und zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems, was zu einer sterilen Neuroinflammation führt. Darüber hinaus wird häufig ein Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke beobachtet, was zu Hirnödemen und Störungen der Ionenhomöostase führt. All diese Veränderungen und mehr, die als frühe Hirnverletzung (EBI) bezeichnet werden, treten innerhalb der ersten paar Tage auf und führen zu neuronalem Verlust und Apoptose⁷.

Etwa 1/3 der Patienten, die an aSAB leiden, entwickeln zwischen dem 4. und 14. Tag eine verzögerte zerebrale Ischämie (DCI)^8. DCI ist definiert als entweder das Auftreten einer fokalen, neurologischen Beeinträchtigung oder ein Abfall von mindestens zwei Punkten auf der Glasgow-Koma-Skala, der mindestens 1 Stunde andauert, wenn andere Ursachen, einschließlich Krampfanfälle und Nachblutungen, ausgeschlossen sind. DCI ist mit einem erhöhten Sterberisiko und einem verminderten funktionellen Ergebnis nach aSAH⁹ assoziiert. Der zerebrale Vasospasmus (CVS), die Verengung der Hirnarterien, ist seit Jahrzehnten mit DCI in Verbindung gebracht und galt früher als alleiniger Grund für DCI. Inzwischen konnte gezeigt werden, dass CVS auch ohne die Entwicklung einer DCI auftreten kann, und seitdem wurden weitere Faktoren wie mikrovaskuläre Thrombosen und Verengungen, kortikale Spreading Depression und eine Entzündungsreaktion von EBI identifiziert^10,11,12.

Aufgrund des großen Einflusses von EBI und DCI auf den Krankheitsverlauf und das Outcome der betroffenen Patienten müssen Tiermodelle diese weitestgehend nachahmen und dennoch reproduzierbar sein. Forscher haben eine Vielzahl verschiedener Modelle bei einer Vielzahl von Tieren, von Mäusen bis hin zu nichtmenschlichen Primaten, eingesetzt, um zu versuchen, aSAB zu simulieren. Sprague-Dawley- und Wistar-Wildtyp-Ratten sind derzeit die am häufigsten verwendeten Versuchstiere, und die gebräuchlichsten Modelle sind das endovaskuläre Perforationsmodell, das Zisternen-Magna-Doppelinjektionsmodell und schließlich das prächiasmatische Einzelinjektionsmodell, das in diesem Artikel^{beschrieben wird 13}.

Das prächiasmatische Modell mit einer einzigen Injektion wurde ursprünglich von Prunell und Kollegen entwickelt, um einigen der Unzulänglichkeiten der anderen experimentellen Modelle entgegenzuwirken¹⁴. Wenn die Operation gemeistert wird, ist sie in hohem Maße reproduzierbar und minimiert die Variation zwischen den Tieren. Das Modell ahmt die SAB beim Menschen in mehreren Punkten nach, einschließlich des plötzlichen Anstiegs der ICP nach der Blutinjektion, der aufgrund eines Abfalls des CBF zu einer vorübergehenden globalen Ischämie führt^15,16. Sie betrifft den vorderen Kreislauf, in dem die meisten aSAB beim Menschen auftreten¹⁷. Die Mortalität liegt zwischen 10 % und 33 %, abhängig von der Studie und der Menge des injizierten Blutes^14,18. Verzögerter Zelltod und Neuroinflammation können an Tag 2 und 7 nachgewiesen werden, was Variablen liefert, um die Folgen von EBI und DCI zu untersuchen ^19,20.

Die Studie enthält eine aktualisierte Beschreibung des prächiasmatischen Einzelinjektionsmodells bei der Ratte sowie eine Beschreibung, wie die ICP-Sonde als Port für die intrathekale Verabreichung von Arzneimitteln genutzt werden kann.

Protocol

Dieses Verfahren wird in Übereinstimmung mit der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union zum Schutz von Tieren, die für wissenschaftliche Zwecke verwendet werden und von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt wurden (Lizenznummer 2016-15-0201-00940), durchgeführt. Die Operation wird so weit wie möglich mit aseptischer Technik durchgeführt, einschließlich steriler Instrumente, Handschuhe, Katheter und Nähte. In der Studie wurden männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 230…

Representative Results

Frauen haben im Vergleich zu Männern ein erhöhtes Risiko für aSAB. Trotzdem werden männliche Nagetiere hauptsächlich in Experimenten verwendet, da die Heterogenität des Brunstzyklus bei Weibchen möglicherweise verzerrt ist. Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse stammen aus einer kürzlich veröffentlichten Publikation, in der weibliche und männliche Ratten verglichen wurden, was bestätigt, dass das Modell bei weiblichen Tieren ähnliche Ergebnisse liefert wie bei männlichen Tieren…

Discussion

Das prächiasmatische Einzelinjektionsmodell der SAB ahmt mehrere wichtige Elemente der menschlichen SAB nach, darunter den Anstieg der ICP, die Reduktion des CBF, die transiente globale Ischämie, die Hochregulation neuroinflammatorischer Marker und CVS 14,15,16,18,19,20. Die ICP-Sonde wurde auch als Port für die intratheka…

Materials

16 G peripheral vein catheter	BD Venflon	393229	Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed
Anesthesia bell/ chamber	Unknown
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL80
Blood pressure (BP) monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Curved forceps, 12 cm x 3	F.S.T	11001-12	For anesthesia
Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm	Homemade		Made from surgical towels
Data acquisition hardware	Adinstruments	ML870 Powerlab
Data acquistion software	Adinstruments	LabChart 6.0
Drill	KMD	1189
Drill controller	Silfradent	300 IN
Flexible light	Schott	KL200
Heating pad	Minco	1135
Hypodermic needle, 20 G	KD Medical	301300	Connects to stereotaxic frame
ICP monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	TEC3
Laptop	Lenovo	T410
Laser doppler monitor	Adinstruments	ML191
Laser doppler probe	Oxford Optronics	MSF100XP	Connects to laser doppler monitor
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13	For anesthesia
Precision syringe, 0.025 mL	Hamilton	547407
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	M900
Surgical microscope	Carl Zeiss	F170
Suture needle	Allgaier	1245	For anesthesia
Temperaure controller	CWE,INC.	TC-1000
Transducer x 2	Adinstruments	MLT0699	Connects to BP and ICP monitor
Ventilator	Ugo Basile	7025
Veterinary clipper	Aesculap	GT421
3-pronged Blair retractor, 13.5 cm	Agnthos	17022–13
Blunt Alm retractor	F.S.T	17008-07
Curved forceps, 12 cm x 2	F.S.T	11001-12
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13
Straight Dumont forceps, 11 cm	F.S.T	11252-00
Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2	F.S.T	13008-12
Straight Iris scissor, 9 cm	F.S.T	14090-09
Straight Vannas scissor, 10.5 cm	F.S.T	15018-10
Absorpable swabs	Kettenbach	31603
Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm	Vömel	14757
Bone wax	Aesculap	1029754
Carbomer eye gel 2 mg/g	Paranova
Cotton swab	Heinz Herenz	WA-1
Cotton tipped applicator x 4	Selefa	120788
Hypodermic needle, 23 G x2	KD Medical	900284	Connects to stopcock. Remove distal end
Hypodermic needle, 23 G x3	KD Medical	900284	Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe
ICP probe:	Homemade		Made of the following:
Polythene tubing, 20 mm	Smiths medical	800/100/200	Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm.
Silicone tubing, 10 mm	Fisher	15202710	ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm.
Silicone tubing, 2 mm	Fisher	11716513	ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm.
Micro hematocrit tubes	Brand	7493 11
OP-towel, 45 cm x75 cm	Mölnlycke	800430
PinPort adapter, 22 G	Instech	PNP3F22
PinPort injector	Instech	PNP3M
Polythene tubing, 2 x 20 cm	Smiths medical	800/100/200	Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm.
Rubberband	Unknown
Scalpel, 10 blade	Kiato	23110
Spinalneedle, 25 G x 3.5''	Braun	5405905-01
Stopcock system, Discofix x 2	Braun	16494C	Connects to transducer
Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3	Ethicon	EH7145H
Syringe, 1 mL	BD Plastipak	1710023
Syringe, luer-lock, 10 mL x 4	BD Plastipak	305959	Connects to transducer
Tissue adhesive glue	3M	1469SB
0.5% Chlorhexidine spirit	Faaborg Pharma	210918
Carprofen 50 mg/mL	ScanVet	43715	Diluted 1:10
Isoflurane	Baxter
Isotonic saline	Amgros	16404
Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL	Amgros	16318