Pre-chiasmatico, singola iniezione di sangue autologo per indurre emorragia subaracnoidea sperimentale in un modello di ratto

Summary

L’emorragia subaracnoidea continua a portare un elevato carico di mortalità e morbilità nell’uomo. Per facilitare ulteriori ricerche sulla condizione e sulla sua fisiopatologia, viene presentato un modello pre-chiasmatico a singola iniezione.

Abstract

Nonostante i progressi nel trattamento negli ultimi decenni, l’emorragia subaracnoidea (SAH) continua a portare un elevato carico di morbilità e mortalità, affliggendo in gran parte una popolazione abbastanza giovane. Diversi modelli animali di SAH sono stati sviluppati per studiare i meccanismi fisiopatologici alla base della SAH e per testare interventi farmacologici. Il modello pre-chiasmatico, a singola iniezione nel ratto presentato in questo articolo è un modello sperimentale di SAH con un volume di sangue predeterminato. In breve, l’animale viene anestetizzato, intubato e tenuto sotto ventilazione meccanica. La temperatura è regolata con una piastra riscaldante. Un catetere viene inserito nell’arteria della coda, consentendo la misurazione continua della pressione sanguigna e il prelievo di sangue. La membrana atlanto-occipitale viene incisa e un catetere per la registrazione della pressione viene posizionato nella cisterna magna per consentire la misurazione della pressione intracerebrale. Questo catetere può essere utilizzato anche per interventi terapeutici intratecali. Il ratto viene posto in una cornice stereotassica, un foro di bava viene praticato anteriormente al bregma e un catetere viene inserito attraverso il foro di bava e posizionato appena anteriormente al chiasma ottico. Il sangue autologo (0,3 ml) viene prelevato dal catetere di coda e iniettato manualmente. Ciò si traduce in un aumento della pressione intracerebrale e una diminuzione del flusso sanguigno cerebrale. L’animale viene tenuto sedato per 30 minuti e somministrato soluzione salina sottocutanea e analgesici. L’animale viene estubato e riportato nella sua gabbia. Il modello pre-chiasmatico ha un alto tasso di riproducibilità e una variazione limitata tra gli animali a causa del volume ematico predeterminato. Imita la SAH negli esseri umani rendendola un modello rilevante per la ricerca sulla SAH.

Introduction

L’emorragia subaracnoidea non traumatica (SAH) è una forma di ictus, che rappresenta circa il 5% di tutti i casi. La causa più comune di SAH non traumatica è l’improvvisa rottura di un aneurisma (aSAH), che rappresenta l’85% degli SAH. Altre cause includono la rottura di una malformazione arterio-venosa, coagulopatie e rottura delle vene nell’emorragia perimesencefalica¹. Il tasso di incidenza è di 9 per 100.000 anni-persona con mortalità intorno a uno su tre e un altro terzo che richiede il supporto della vita quotidiana dopo SAH ^2,3.

Dopo la stabilizzazione iniziale e la conferma della diagnosi, il trattamento dipende dalla gravità dell’emorragia. I pazienti più gravemente colpiti avranno un drenaggio extra-ventricolare inserito nei ventricoli per ridurre la pressione intracerebrale (ICP) e saranno ricoverati nell’unità di terapia neurointensiva, dove saranno monitorati attentamente. I pazienti saranno sottoposti a un’angiografia per identificare il (probabile) aneurisma e successivamente avranno l’aneurisma arrotolato o tagliato per prevenire il risanguinamento⁴. Nonostante numerosi studi di terapie farmacologiche, solo la nimodipina, un antagonista dei canali del calcio, ha dimostrato di migliorare i risultati⁵. Sono attualmente in corso diversi studi clinici. Si prega di consultare la recensione di Daou e colleghi per un elenco completo⁶.

La rottura di un aneurisma è stata descritta come l’insorgenza improvvisa del peggior mal di testa mai sperimentato o un mal di testa tuono. La rottura provoca un forte aumento dell’ICP seguito da una riduzione del flusso sanguigno cerebrale (CBF). Questa riduzione provoca ischemia globale del cervello, che può provocare una perdita di coscienza. Questo percorso più meccanicistico, insieme alla rottura avviata degli elementi stravasati del sangue, dà origine al rilascio di citochine e all’attivazione del sistema immunitario innato con conseguente neuroinfiammazione sterile. Inoltre, si osserva spesso la rottura della barriera emato-encefalica, con conseguente edema cerebrale e disturbo nell’omeostasi ionica. Tutti questi cambiamenti e altro ancora, coniati come lesioni cerebrali precoci (EBI), si verificano entro i primi due giorni e provocano perdita neuronale e apoptosi⁷.

Circa 1/3 dei pazienti affetti da aSAH svilupperà ischemia cerebrale ritardata (DCI) tra il giorno 4-14⁸. Il DCI è definito come il debutto di una compromissione neurologica focale o una caduta di almeno due punti sulla scala del coma di Glasgow della durata minima di 1 ora, quando sono escluse altre cause, tra cui convulsioni e risanguinamento. Il DCI è associato ad un aumentato rischio di morte e ad una diminuzione dell’esito funzionale dopo aSAH⁹. Il vasospasmo cerebrale (CVS), il restringimento delle arterie cerebrali, è noto per essere associato a DCI per decenni e in precedenza si pensava che fosse l’unica ragione per DCI. Da allora è stato dimostrato che la CVS può verificarsi senza lo sviluppo di DCI e da allora sono stati identificati più fattori, tra cui trombosi e costrizione microvascolare, depressione corticale e una risposta infiammatoria di EBI 10,11,12.

A causa della grande influenza di EBI e DCI sul decorso della malattia e sull’esito dei pazienti colpiti, i modelli animali devono imitarli al massimo grado possibile, pur essendo riproducibili. I ricercatori hanno impiegato una vasta gamma di modelli diversi in una varietà di animali, dai topi ai primati non umani, per cercare di simulare l’aSAH. I ratti wildtype Sprague-Dawley e Wistar sono attualmente gli animali da laboratorio più comunemente utilizzati, e i modelli più comuni sono il modello di perforazione endovascolare, il modello cisterna-magna a doppia iniezione e infine il modello di iniezione singola pre-chiasmatica, che sarà descritto in questo articolo¹³.

Il modello pre-chiasmatico a singola iniezione è stato originariamente sviluppato da Prunell e colleghi per contrastare alcune delle carenze degli altri modelli sperimentali¹⁴. La chirurgia, una volta padroneggiata, è altamente riproducibile e riduce al minimo le variazioni tra gli animali. Il modello imita SAH nell’uomo su più punti, incluso l’improvviso aumento di ICP dopo l’iniezione di sangue, con conseguente ischemia globale transitoria a causa di una caduta del CBF^15,16. Colpisce la circolazione anteriore, che è dove si verifica la maggior parte dell’aSAH negli esseri umani¹⁷. La mortalità varia dal 10% al 33% a seconda dello studio e della quantità di sangue iniettato^14,18. La morte cellulare ritardata e la neuroinfiammazione possono essere rilevate nei giorni 2 e 7, fornendo così variabili per studiare le conseguenze di EBI e DCI ^19,20.

Lo studio presenta una descrizione aggiornata del modello di iniezione singola pre-chiasmatica nel ratto insieme a una descrizione di come utilizzare la sonda ICP come porta per la somministrazione intratecale di prodotti farmaceutici.

Protocol

Questa procedura viene eseguita in conformità con la direttiva dell’Unione europea 2010/63 / UE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e approvata dall’Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali (licenza n. 2016-15-0201-00940). La chirurgia viene eseguita utilizzando la tecnica asettica nella misura più ampia possibile, compresi strumenti sterili, guanti, cateteri e punti di sutura. Lo studio ha utilizzato ratti Sprague-Dawley maschi e femmine del peso di 230-350 g, alloggiati in…

Representative Results

Le donne hanno un aumentato rischio di aSAH rispetto agli uomini. Nonostante ciò, i roditori maschi sono utilizzati principalmente negli esperimenti a causa di possibili pregiudizi dovuti all’eterogeneità del ciclo di estro nelle femmine. I risultati rappresentativi qui presentati provengono da una recente pubblicazione che confronta ratti femmina e maschio, confermando che il modello produce risultati simili negli animali femmina rispetto al maschio21. Lo studio ha incluso 34 femmine di ratti S…

Discussion

Il modello pre-chiasmatico a singola iniezione di SAH imita diversi elementi importanti della SAH umana, tra cui il picco di ICP, la riduzione del CBF, l’ischemia globale transitoria, la sovraregolazione dei marcatori neuroinfiammatori e CVS 14,15,16,18,19,20. La sonda ICP è stata utilizzata anche come porta per la somminist…

Materials

16 G peripheral vein catheter	BD Venflon	393229	Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed
Anesthesia bell/ chamber	Unknown
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL80
Blood pressure (BP) monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Curved forceps, 12 cm x 3	F.S.T	11001-12	For anesthesia
Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm	Homemade		Made from surgical towels
Data acquisition hardware	Adinstruments	ML870 Powerlab
Data acquistion software	Adinstruments	LabChart 6.0
Drill	KMD	1189
Drill controller	Silfradent	300 IN
Flexible light	Schott	KL200
Heating pad	Minco	1135
Hypodermic needle, 20 G	KD Medical	301300	Connects to stereotaxic frame
ICP monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	TEC3
Laptop	Lenovo	T410
Laser doppler monitor	Adinstruments	ML191
Laser doppler probe	Oxford Optronics	MSF100XP	Connects to laser doppler monitor
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13	For anesthesia
Precision syringe, 0.025 mL	Hamilton	547407
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	M900
Surgical microscope	Carl Zeiss	F170
Suture needle	Allgaier	1245	For anesthesia
Temperaure controller	CWE,INC.	TC-1000
Transducer x 2	Adinstruments	MLT0699	Connects to BP and ICP monitor
Ventilator	Ugo Basile	7025
Veterinary clipper	Aesculap	GT421
3-pronged Blair retractor, 13.5 cm	Agnthos	17022–13
Blunt Alm retractor	F.S.T	17008-07
Curved forceps, 12 cm x 2	F.S.T	11001-12
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13
Straight Dumont forceps, 11 cm	F.S.T	11252-00
Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2	F.S.T	13008-12
Straight Iris scissor, 9 cm	F.S.T	14090-09
Straight Vannas scissor, 10.5 cm	F.S.T	15018-10
Absorpable swabs	Kettenbach	31603
Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm	Vömel	14757
Bone wax	Aesculap	1029754
Carbomer eye gel 2 mg/g	Paranova
Cotton swab	Heinz Herenz	WA-1
Cotton tipped applicator x 4	Selefa	120788
Hypodermic needle, 23 G x2	KD Medical	900284	Connects to stopcock. Remove distal end
Hypodermic needle, 23 G x3	KD Medical	900284	Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe
ICP probe:	Homemade		Made of the following:
Polythene tubing, 20 mm	Smiths medical	800/100/200	Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm.
Silicone tubing, 10 mm	Fisher	15202710	ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm.
Silicone tubing, 2 mm	Fisher	11716513	ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm.
Micro hematocrit tubes	Brand	7493 11
OP-towel, 45 cm x75 cm	Mölnlycke	800430
PinPort adapter, 22 G	Instech	PNP3F22
PinPort injector	Instech	PNP3M
Polythene tubing, 2 x 20 cm	Smiths medical	800/100/200	Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm.
Rubberband	Unknown
Scalpel, 10 blade	Kiato	23110
Spinalneedle, 25 G x 3.5''	Braun	5405905-01
Stopcock system, Discofix x 2	Braun	16494C	Connects to transducer
Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3	Ethicon	EH7145H
Syringe, 1 mL	BD Plastipak	1710023
Syringe, luer-lock, 10 mL x 4	BD Plastipak	305959	Connects to transducer
Tissue adhesive glue	3M	1469SB
0.5% Chlorhexidine spirit	Faaborg Pharma	210918
Carprofen 50 mg/mL	ScanVet	43715	Diluted 1:10
Isoflurane	Baxter
Isotonic saline	Amgros	16404
Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL	Amgros	16318