Pre-chiasmatisk, enkelt injeksjon av autologt blod for å indusere eksperimentell subaraknoid blødning i en rottemodell

Summary

Subaraknoidalblødning fortsetter å bære en høy byrde av dødelighet og sykelighet hos mennesker. For å lette videre forskning på tilstanden og dens patofysiologi, presenteres en pre-chiasmatisk, enkeltinjeksjonsmodell.

Abstract

Til tross for fremskritt i behandlingen de siste tiårene, fortsetter subaraknoidalblødning (SAH) å bære en høy byrde av sykelighet og dødelighet, i stor grad plager en ganske ung befolkning. Flere dyremodeller av SAH er utviklet for å undersøke de patofysiologiske mekanismene bak SAH og for å teste farmakologiske inngrep. Den pre-chiasmatiske, enkeltinjeksjonsmodellen i rotte presentert i denne artikkelen er en eksperimentell modell av SAH med et forhåndsbestemt blodvolum. Kort fortalt blir dyret bedøvet, intubert og holdt under mekanisk ventilasjon. Temperaturen reguleres med en varmepute. Et kateter er plassert i halearterien, noe som muliggjør kontinuerlig blodtrykksmåling samt blodprøvetaking. Den atlantooccipitale membranen snittes og et kateter for trykkregistrering plasseres i cisterna magna for å muliggjøre intracerebral trykkmåling. Dette kateteret kan også brukes til intratekale terapeutiske inngrep. Rotta er plassert i en stereotaktisk ramme, et burrhull bores fremre for bregma, og et kateter settes inn gjennom burrhullet og plasseres like foran den optiske chiasmen. Autologt blod (0,3 ml) trekkes ut av halekateteret og injiseres manuelt. Dette resulterer i en økning av intracerebral trykk og en reduksjon av cerebral blodstrøm. Dyret holdes bedøvet i 30 min og gis subkutan saltvann og smertestillende midler. Dyret er ekstubert og returnert til buret. Den pre-chiasmatiske modellen har høy reproduserbarhetshastighet og begrenset variasjon mellom dyr på grunn av det forhåndsbestemte blodvolumet. Det etterligner SAH hos mennesker, noe som gjør det til en relevant modell for SAH-forskning.

Introduction

Ikke-traumatisk subaraknoidalblødning (SAH) er en form for hjerneslag, som representerer rundt 5% av alle tilfeller. Den vanligste årsaken til ikke-traumatisk SAH er den plutselige brudd på en aneurisme (aSAH), som står for 85% av SAH. Andre årsaker inkluderer brudd på en arteriovenøs misdannelse, koagulopatier og brudd på vener i perimesencephalic blødning¹. Insidensraten er 9 per 100 000 personår, med dødelighet rundt en av tre og en annen tredjedel som krever støtte fra dagliglivet etter SAH ^2,3.

Etter innledende stabilisering og diagnosebekreftelse avhenger behandlingen av alvorlighetsgraden av blødningen. De hardest rammede pasientene vil få inn et ekstraventrikkeldren i ventriklene for å redusere det intracerebrale trykket (ICP) og bli innlagt på nevrointensivavdelingen, hvor de overvåkes nøye. Pasienter vil gjennomgå en angiografi for å identifisere (sannsynlig) aneurisme og etterpå har aneurisme kveilet eller klippet for å hindre ny blødning⁴. Til tross for mange studier av farmakologiske terapier, har bare nimodipin, en kalsiumkanalantagonist, vist seg å forbedre resultatene⁵. Flere kliniske studier er for tiden i gang. Se gjennomgangen av Daou og kolleger for en omfattende liste⁶.

Brudd på en aneurisme har blitt beskrevet som den plutselige utbruddet av den verste hodepine noensinne opplevd eller en tordenskrall hodepine. Bruddet resulterer i en bratt økning i ICP etterfulgt av en reduksjon i cerebral blodstrøm (CBF). Denne reduksjonen resulterer i global iskemi i hjernen, noe som kan føre til tap av bevissthet. Denne mer mekanistiske banen, sammen med den initierte nedbrytningen av de ekstravaserte elementene i blodet, gir opphav til cytokinfrigjøring og aktivering av det medfødte immunsystemet som resulterer i steril nevroinflammasjon. Videre observeres ofte nedbrytning av blod-hjernebarrieren, noe som resulterer i cerebralt ødem og forstyrrelse i ionhomeostasen. Alle disse endringene og mer, myntet tidlig hjerneskade (EBI), forekommer i løpet av de første par dagene og resulterer i nevrontap og apoptose⁷.

Omtrent 1/3 av pasientene som er rammet av aSAH vil utvikle forsinket cerebral iskemi (DCI) mellom dag 4-14⁸. DCI er definert som enten debut av fokal, nevrologisk svekkelse eller et fall på minimum to punkter på komaskalaen i Glasgow som varer i minimum 1 time, når andre årsaker, inkludert kramper og ny blødning er utelukket. DCI er forbundet med økt risiko for død og redusert funksjonsutfall etter aSAH⁹. Cerebral vasospasme (CVS), innsnevring av cerebrale arterier, har vært kjent for å være assosiert med DCI i flere tiår og ble tidligere antatt å være den eneste årsaken til DCI. Det har siden blitt vist at CVS kan oppstå uten utvikling av DCI og flere faktorer, inkludert mikrovaskulær trombose og innsnevring, kortikal spredningsdepresjon og en inflammatorisk respons av EBI har siden blitt identifisert^10,11,12.

På grunn av den store innflytelsen fra EBI og DCI på sykdomsforløpet og utfallet av pasientene som rammes, må dyremodeller etterligne disse i størst mulig grad, samtidig som de er reproduserbare. Forskere har brukt et bredt spekter av forskjellige modeller i en rekke dyr fra mus til ikke-menneskelige primater for å prøve å simulere aSAH. Sprague-Dawley og Wistar villtyperotter er for tiden de mest brukte laboratoriedyrene, og de vanligste modellene er endovaskulær perforasjonsmodell, cisterna-magna dobbeltinjeksjonsmodell, og til slutt den pre-chiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen, som vil bli beskrevet i denne artikkelen¹³.

Den pre-chiasmatiske, enkeltinjeksjonsmodellen ble opprinnelig utviklet av Prunell og kolleger for å motvirke noen av manglene i de andre eksperimentelle modellene¹⁴. Operasjonen, når den mestres, er svært reproduserbar og minimerer variasjon mellom dyr. Modellen etterligner SAH hos mennesker på flere punkter, inkludert den plutselige økningen i ICP etter injeksjon av blod, noe som resulterer i forbigående global iskemi på grunn av et fall i CBF^15,16. Det påvirker den fremre sirkulasjonen, som er der de fleste aSAH hos mennesker forekommer¹⁷. Dødeligheten varierer fra 10% -33% avhengig av studien og mengden blod injisert^14,18. Forsinket celledød og nevroinflammasjon kan påvises dag 2 og 7 og dermed gi variabler for å studere konsekvensene av EBI og DCI^19,20.

Studien presenterer en oppdatert beskrivelse av den prechiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen hos rotte sammen med en beskrivelse av hvordan ICP-sonden kan brukes som en port for intratekal administrering av legemidler.

Protocol

Denne prosedyren utføres i samsvar med EUs direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og godkjent av det danske dyreforsøkstilsynet (lisensnr. 2016-15-0201-00940). Kirurgi utføres ved hjelp av aseptisk teknikk i størst mulig grad, inkludert sterile instrumenter, hansker, katetre og suturer. Studien brukte mannlige og kvinnelige Sprague-Dawley-rotter som veier 230-350 g, gruppe plassert i 12-timers lys / mørk syklus, med konstant temperatur på 22 ° C (± 2 ° C) og fuktighet på…

Representative Results

Kvinner har økt risiko for aSAH sammenlignet med menn. Til tross for dette brukes mannlige gnagere primært i eksperimenter på grunn av mulig skjevhet fra heterogenitet av østrussyklus hos kvinner. De representative resultatene som presenteres her er fra en nylig publikasjon som sammenligner hunn- og hannrotter, og bekrefter at modellen gir lignende resultater hos hunndyr sammenlignet med hannrotter21. Studien inkluderte 34 kvinnelige Sprague-Dawley-rotter (18 SAH og 16 humbug). Shams hadde ikk…

Discussion

Den pre-chiasmatiske enkeltinjeksjonsmodellen til SAH etterligner flere viktige elementer i human SAH, inkludert piggen i ICP, reduksjon av CBF, forbigående global iskemi, oppregulering av nevroinflammatoriske markører og CVS 14,15,16,18,19,20. ICP-sonden ble også brukt som port for intratekal administrering (<strong class…

Materials

16 G peripheral vein catheter	BD Venflon	393229	Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed
Anesthesia bell/ chamber	Unknown
Blood gas analyzer	Radiometer	ABL80
Blood pressure (BP) monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Curved forceps, 12 cm x 3	F.S.T	11001-12	For anesthesia
Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm	Homemade		Made from surgical towels
Data acquisition hardware	Adinstruments	ML870 Powerlab
Data acquistion software	Adinstruments	LabChart 6.0
Drill	KMD	1189
Drill controller	Silfradent	300 IN
Flexible light	Schott	KL200
Heating pad	Minco	1135
Hypodermic needle, 20 G	KD Medical	301300	Connects to stereotaxic frame
ICP monitor	Adinstruments	ML117	Connects to Powerlab
Isoflurane vaporizer	Ohmeda	TEC3
Laptop	Lenovo	T410
Laser doppler monitor	Adinstruments	ML191
Laser doppler probe	Oxford Optronics	MSF100XP	Connects to laser doppler monitor
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13	For anesthesia
Precision syringe, 0.025 mL	Hamilton	547407
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	M900
Surgical microscope	Carl Zeiss	F170
Suture needle	Allgaier	1245	For anesthesia
Temperaure controller	CWE,INC.	TC-1000
Transducer x 2	Adinstruments	MLT0699	Connects to BP and ICP monitor
Ventilator	Ugo Basile	7025
Veterinary clipper	Aesculap	GT421
3-pronged Blair retractor, 13.5 cm	Agnthos	17022–13
Blunt Alm retractor	F.S.T	17008-07
Curved forceps, 12 cm x 2	F.S.T	11001-12
Needle holder, 13 cm	F.S.T	12001-13
Straight Dumont forceps, 11 cm	F.S.T	11252-00
Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2	F.S.T	13008-12
Straight Iris scissor, 9 cm	F.S.T	14090-09
Straight Vannas scissor, 10.5 cm	F.S.T	15018-10
Absorpable swabs	Kettenbach	31603
Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm	Vömel	14757
Bone wax	Aesculap	1029754
Carbomer eye gel 2 mg/g	Paranova
Cotton swab	Heinz Herenz	WA-1
Cotton tipped applicator x 4	Selefa	120788
Hypodermic needle, 23 G x2	KD Medical	900284	Connects to stopcock. Remove distal end
Hypodermic needle, 23 G x3	KD Medical	900284	Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe
ICP probe:	Homemade		Made of the following:
Polythene tubing, 20 mm	Smiths medical	800/100/200	Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm.
Silicone tubing, 10 mm	Fisher	15202710	ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm.
Silicone tubing, 2 mm	Fisher	11716513	ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm.
Micro hematocrit tubes	Brand	7493 11
OP-towel, 45 cm x75 cm	Mölnlycke	800430
PinPort adapter, 22 G	Instech	PNP3F22
PinPort injector	Instech	PNP3M
Polythene tubing, 2 x 20 cm	Smiths medical	800/100/200	Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm.
Rubberband	Unknown
Scalpel, 10 blade	Kiato	23110
Spinalneedle, 25 G x 3.5''	Braun	5405905-01
Stopcock system, Discofix x 2	Braun	16494C	Connects to transducer
Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3	Ethicon	EH7145H
Syringe, 1 mL	BD Plastipak	1710023
Syringe, luer-lock, 10 mL x 4	BD Plastipak	305959	Connects to transducer
Tissue adhesive glue	3M	1469SB
0.5% Chlorhexidine spirit	Faaborg Pharma	210918
Carprofen 50 mg/mL	ScanVet	43715	Diluted 1:10
Isoflurane	Baxter
Isotonic saline	Amgros	16404
Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL	Amgros	16318