Inyección única prequiasmática de sangre autóloga para inducir hemorragia subaracnoidea experimental en un modelo de rata
Summary
La hemorragia subaracnoidea sigue conllevando una alta carga de mortalidad y morbilidad en el hombre. Para facilitar la investigación adicional sobre la condición y su fisiopatología, se presenta un modelo pre-quiasmático de inyección única.
Abstract
A pesar de los avances en el tratamiento en las últimas décadas, la hemorragia subaracnoidea (HSA) sigue conllevando una alta carga de morbilidad y mortalidad, afectando en gran medida a una población bastante joven. Se han desarrollado varios modelos animales de HSA para investigar los mecanismos fisiopatológicos detrás de la HSA y para probar intervenciones farmacológicas. El modelo de inyección única pre-quiasmático en la rata presentado en este artículo es un modelo experimental de HSA con un volumen sanguíneo predeterminado. Brevemente, el animal es anestesiado, intubado y mantenido bajo ventilación mecánica. La temperatura se regula con una almohadilla térmica. Se coloca un catéter en la arteria caudal, lo que permite la medición continua de la presión arterial, así como la toma de muestras de sangre. La membrana atlantooccipital se incide y se coloca un catéter para el registro de presión en la cisterna magna para permitir la medición de la presión intracerebral. Este catéter también se puede utilizar para intervenciones terapéuticas intratecales. La rata se coloca en un marco estereotáxico, se perfora un orificio de rebabas anteriormente al bregma, y se inserta un catéter a través del orificio de rebaba y se coloca justo antes del quiasma óptico. La sangre autóloga (0,3 ml) se extrae del catéter de la cola y se inyecta manualmente. Esto resulta en un aumento de la presión intracerebral y una disminución del flujo sanguíneo cerebral. El animal se mantiene sedado durante 30 min y se le administra solución salina subcutánea y analgésicos. El animal es extubado y devuelto a su jaula. El modelo prequiasmático tiene una alta tasa de reproducibilidad y una variación limitada entre animales debido al volumen sanguíneo predeterminado. Imita la HSA en humanos, lo que la convierte en un modelo relevante para la investigación de la HAS.
Introduction
La hemorragia subaracnoidea no traumática (HSA) es una forma de accidente cerebrovascular, que representa alrededor del 5% de todos los casos. La causa más común de HSA no traumática es la ruptura repentina de un aneurisma (HASA), que representa el 85% de los HSA. Otras causas incluyen la ruptura de una malformación arterio-venosa, coagulopatías y ruptura de venas en hemorragia perimesencefálica1. La tasa de incidencia es de 9 por 100.000 años-persona, con una mortalidad de alrededor de uno de cada tres y otro tercio que requiere el apoyo de la vida diaria después de la HAS 2,3.
Después de la estabilización inicial y la confirmación del diagnóstico, el tratamiento depende de la gravedad de la hemorragia. A los pacientes más gravemente afectados se les insertará un drenaje extraventricular en los ventrículos para reducir la presión intracerebral (PIC) y serán ingresados en la unidad de cuidados neurointensivos, donde serán monitoreados de cerca. Los pacientes se someterán a una angiografía para identificar el aneurisma (probable) y luego tendrán el aneurisma enrollado o recortado para evitar que vuelva a sangrar4. A pesar de numerosos ensayos de terapias farmacológicas, sólo la nimodipina, un antagonista de los canales de calcio, ha demostrado mejorar los resultados5. Actualmente se están llevando a cabo múltiples ensayos clínicos. Consulte la revisión de Daou y sus colegas para obtener una lista extensa6.
La ruptura de un aneurisma se ha descrito como la aparición repentina del peor dolor de cabeza jamás experimentado o un dolor de cabeza de trueno. La ruptura resulta en un fuerte aumento de la PIC seguido de una reducción en el flujo sanguíneo cerebral (CBF). Esta reducción resulta en isquemia global del cerebro, lo que puede resultar en una pérdida de conciencia. Esta vía más mecanicista, junto con la descomposición iniciada de los elementos extravasados de la sangre, da lugar a la liberación de citoquinas y la activación del sistema inmune innato que resulta en neuroinflamación estéril. Además, a menudo se observa la ruptura de la barrera hematoencefálica, lo que resulta en edema cerebral y alteración en la homeostasis iónica. Todos estos cambios y más, acuñados como lesión cerebral temprana (EBI), ocurren dentro de los primeros días y resultan en pérdida neuronal y apoptosis7.
Aproximadamente 1/3 de los pacientes afectados por aSAH desarrollarán isquemia cerebral retardada (DCI) entre el día 4-148. La DCI se define como el debut de un deterioro neurológico focal o una caída de un mínimo de dos puntos en la escala de coma de Glasgow que dura un mínimo de 1 h, cuando se excluyen otras causas, incluidas las convulsiones y el nuevo sangrado. La DCI se asocia con un mayor riesgo de muerte y una disminución del resultado funcional después de la HSA9. Se sabe que el vasoespasmo cerebral (CVS), el estrechamiento de las arterias cerebrales, está asociado con DCI durante décadas y anteriormente se pensaba que era la única razón para DCI. Desde entonces se ha demostrado que CVS puede ocurrir sin el desarrollo de DCI y desde entonces se han identificado más factores, incluyendo trombosis microvascular y constricción, depresión de propagación cortical y una respuesta inflamatoria de EBI10,11,12.
Debido a la gran influencia de EBI y DCI en el curso de la enfermedad y el resultado de los pacientes afectados, los modelos animales necesitan imitarlos en el mayor grado posible, sin dejar de ser reproducibles. Los investigadores han empleado una amplia gama de modelos diferentes en una variedad de animales, desde ratones hasta primates no humanos, para tratar de simular aSAH. Las ratas salvajes Sprague-Dawley y Wistar son actualmente los animales de laboratorio más utilizados, y los modelos más comunes son el modelo de perforación endovascular, el modelo de doble inyección cisterna-magna y, por último, el modelo de inyección única prequiasmática, que se describirá en este artículo13.
El modelo pre-quiasmático de inyección única fue desarrollado originalmente por Prunell y colegas para contrarrestar algunas de las deficiencias de los otros modelos experimentales14. La cirugía, cuando se domina, es altamente reproducible y minimiza la variación entre animales. El modelo imita la HSA en humanos en múltiples puntos, incluido el aumento repentino de la PIC después de la inyección de sangre, lo que resulta en isquemia global transitoria debido a una caída en el CBF15,16. Afecta la circulación anterior, que es donde ocurre la mayoría de los aSAH en humanos17. La mortalidad oscila entre el 10% y el 33% dependiendo del estudio y de la cantidad de sangre inyectada14,18. La muerte celular retardada y la neuroinflamación pueden detectarse en los días 2 y 7, proporcionando variables para estudiar las consecuencias de EBI y DCI19,20.
El estudio presenta una descripción actualizada del modelo de inyección única prequiasmática en la rata junto con una descripción de cómo utilizar la sonda ICP como puerto para la administración intratecal de productos farmacéuticos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de inyección única prequiasmática de la HSA imita varios elementos importantes de la HSA humana, incluido el aumento de la PIC, la reducción de la CBF, la isquemia global transitoria, la regulación positiva de los marcadores neuroinflamatorios y la MVC 14,15,16,18,19,20. La sonda ICP también se utilizó como p…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por la Fundación Lundbeck y la Beca de Excelencia Lundbeck (no. R59-A5404). Los financiadores no tuvieron ningún papel en ninguna parte del manuscrito.
Materials
| 16 G peripheral vein catheter | BD Venflon | 393229 | Needle shortened, distal 1 cm curved. Wings removed |
| Anesthesia bell/ chamber | Unknown | ||
| Blood gas analyzer | Radiometer | ABL80 | |
| Blood pressure (BP) monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Curved forceps, 12 cm x 3 | F.S.T | 11001-12 | For anesthesia |
| Cylindrical pillow, 28 cm x 4 cm | Homemade | Made from surgical towels | |
| Data acquisition hardware | Adinstruments | ML870 Powerlab | |
| Data acquistion software | Adinstruments | LabChart 6.0 | |
| Drill | KMD | 1189 | |
| Drill controller | Silfradent | 300 IN | |
| Flexible light | Schott | KL200 | |
| Heating pad | Minco | 1135 | |
| Hypodermic needle, 20 G | KD Medical | 301300 | Connects to stereotaxic frame |
| ICP monitor | Adinstruments | ML117 | Connects to Powerlab |
| Isoflurane vaporizer | Ohmeda | TEC3 | |
| Laptop | Lenovo | T410 | |
| Laser doppler monitor | Adinstruments | ML191 | |
| Laser doppler probe | Oxford Optronics | MSF100XP | Connects to laser doppler monitor |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | For anesthesia |
| Precision syringe, 0.025 mL | Hamilton | 547407 | |
| Stereotaxic frame | Kopf Instruments | M900 | |
| Surgical microscope | Carl Zeiss | F170 | |
| Suture needle | Allgaier | 1245 | For anesthesia |
| Temperaure controller | CWE,INC. | TC-1000 | |
| Transducer x 2 | Adinstruments | MLT0699 | Connects to BP and ICP monitor |
| Ventilator | Ugo Basile | 7025 | |
| Veterinary clipper | Aesculap | GT421 | |
| 3-pronged Blair retractor, 13.5 cm | Agnthos | 17022–13 | |
| Blunt Alm retractor | F.S.T | 17008-07 | |
| Curved forceps, 12 cm x 2 | F.S.T | 11001-12 | |
| Needle holder, 13 cm | F.S.T | 12001-13 | |
| Straight Dumont forceps, 11 cm | F.S.T | 11252-00 | |
| Straight Halsted-Mosquito hemostat x 2 | F.S.T | 13008-12 | |
| Straight Iris scissor, 9 cm | F.S.T | 14090-09 | |
| Straight Vannas scissor, 10.5 cm | F.S.T | 15018-10 | |
| Absorpable swabs | Kettenbach | 31603 | |
| Black silk thread, 4-0, 5 x 15 cm | Vömel | 14757 | |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | |
| Carbomer eye gel 2 mg/g | Paranova | ||
| Cotton swab | Heinz Herenz | WA-1 | |
| Cotton tipped applicator x 4 | Selefa | 120788 | |
| Hypodermic needle, 23 G x2 | KD Medical | 900284 | Connects to stopcock. Remove distal end |
| Hypodermic needle, 23 G x3 | KD Medical | 900284 | Remove distal end. 2 connects to stopcock, 1 to syringe |
| ICP probe: | Homemade | Made of the following: | |
| Polythene tubing, 20 mm | Smiths medical | 800/100/200 | Inner diameter (ID): 0.58 mm, Outer diameter (OD): 0.96 mm. |
| Silicone tubing, 10 mm | Fisher | 15202710 | ID: 0.76 mm, OD: 2.4 mm. |
| Silicone tubing, 2 mm | Fisher | 11716513 | ID: 1.0 mm, OD: 3.0 mm. |
| Micro hematocrit tubes | Brand | 7493 11 | |
| OP-towel, 45 cm x75 cm | Mölnlycke | 800430 | |
| PinPort adapter, 22 G | Instech | PNP3F22 | |
| PinPort injector | Instech | PNP3M | |
| Polythene tubing, 2 x 20 cm | Smiths medical | 800/100/200 | Connects to syringe. ID: 0.58 mm, OD: 0.96 mm. |
| Rubberband | Unknown | ||
| Scalpel, 10 blade | Kiato | 23110 | |
| Spinalneedle, 25 G x 3.5'' | Braun | 5405905-01 | |
| Stopcock system, Discofix x 2 | Braun | 16494C | Connects to transducer |
| Suture, 4-0, monofil, non-resorbable x 3 | Ethicon | EH7145H | |
| Syringe, 1 mL | BD Plastipak | 1710023 | |
| Syringe, luer-lock, 10 mL x 4 | BD Plastipak | 305959 | Connects to transducer |
| Tissue adhesive glue | 3M | 1469SB | |
| 0.5% Chlorhexidine spirit | Faaborg Pharma | 210918 | |
| Carprofen 50 mg/mL | ScanVet | 43715 | Diluted 1:10 |
| Isoflurane | Baxter | ||
| Isotonic saline | Amgros | 16404 | |
| Lidocaine-Adrenaline 10 mg/5 µg/mL | Amgros | 16318 |
Riferimenti
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