אימונופנוטיפינג ומיון תאים של חברי כנסת אנושיים ממקורות ראשוניים אנושיים או מובחנים במבחנה מאבות ההמטופיאטיים
Summary
כאן, אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג לאפיון של בידול מגה-קריוציטים, ומראים כיצד אסטרטגיה זו מאפשרת מיון של מגה-קריוציטים בשלבים שונים באמצעות סדרן תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. המתודולוגיה יכולה להיות מיושמת על רקמות ראשוניות אנושיות, אלא גם על מגה-קריוציטים הנוצרים בתרבות במבחנה.
Abstract
התמיינות Megakaryocyte (MK) כוללת מספר מחזורים אנדומיטוטיים שתוצאתם פוליפלואידית מאוד (להגיע אפילו >64N) ותא גדול מאוד (40-60 מיקרומטר). בניגוד לידע הגדל במהירות במגה-קריופוסיס ברמה הביולוגית של התא וברמה המולקולרית, אפיון המגה-קריופוסיס על ידי ציטומטריית זרימה מוגבל לזיהוי חברי כנסת בוגרים באמצעות סמני פני שטח ספציפיים לשושלת, בעוד שלבי הבידול הח”כים המוקדמים עדיין לא נחקרו. כאן אנו מציגים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג המאפשרת זיהוי שלבי בידול ח”כים עוקבים, עם מעמד של פלוידיה גוברת, במקורות ראשוניים אנושיים או בתרבויות במבחנה עם פאנל המשלב סמני שטח ספציפיים ולא ספציפיים של ח”כים. למרות גודלו ושבריריותו, חברי הכנסת יכולים להיות אימונופנוטיים באמצעות הפאנל הנ”ל ומועשרים על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות בתנאים מסוימים של לחץ וקוטר זרבובית. גישה זו מקלה על מחקרים רב-אומיקים, במטרה להבין טוב יותר את המורכבות של מגה-קריופוזיס וייצור טסיות טיס פנים בבני אדם. אפיון טוב יותר של megakaryopoiesis עשוי להוות יסוד באבחון או פרוגנוזה של פתולוגיות הקשורות לשושלת וממאירות.
Introduction
Megakaryocytes (חברי כנסת) לפתח מתאי גזע hematopoietic (HSCs) בעקבות תהליך מורכב בשם megakaryopoiesis, אשר מתוזמר בעיקר על ידי ההורמון תרומבופויאטין (TPO). התפיסה הקלאסית של megakaryopoiesis מתארת את המסע התאי מ- HSCs דרך רצף של שלבים היררכיים של אבות מחויבים ותאי קודמן, המוביל בסופו של דבר לח”כ בוגר. במהלך ההבשלה, חברי הכנסת חווים סבבים מרובים של אנדומיטוזיס, מפתחים מערכת קרום תיחום תאית מורכבת (DMS), המספקת מספיק משטח ממברנה לייצור טסיות דם, ומייצרים ביעילות ואורזים את שפע הגורמים הכלולים בגרגרים השונים שירשו טסיות הדם הבוגרות1,2,3. כתוצאה מכך, חברי כנסת בוגרים הם תאים גדולים (40-60 מיקרומטר) המאופיינים בגרעין פוליפלואידי מאוד (המגיע אפילו >64N). מחקרים שנעשו לאחרונה מצביעים על דרכים חלופיות שבהן HSCs מבדילים בין חברי כנסת העוקפים את מחסומי המחויבות המסורתיים לשושלת בתגובה לתנאים פיזיו-פתולוגיים מסוימים4,5,6,7,8,9,10,11. ממצאים אלה מדגישים כי ההבחנה ההמטופובית כלפי הח”כ הבוגר היא רצף ותהליך הסתגלותי הנותן מענה לצרכים ביולוגיים.
עם הידע הגובר על ביולוגיה של התא וההיבטים המולקולריים המאפיינים את megakaryopoiesis12, רוב המחקר המוקדש לחקר התהליך על ידי cytometry זרימה מוגבלים לזיהוי של חברי כנסת בוגרים באמצעות סמני פני השטח ספציפיים לשושלת (כלומר, CD42A / B, CD41 / CD61), בעוד שלבי בידול ח”כים מוקדמים יותר נותרו לא נחקרו. תיעדנו בעבר אסטרטגיה לביים megakaryopoiesis במח עצם העכבר ומח העצם נגזר תרבויות MK13,14, אשר הסתגלנו והחלנו על בני אדם15. במאמר הנוכחי אנו מראים אסטרטגיית אימונופנוטיפינג המאפשרת אפיון של מגה-קרויף, מ- HSCs לחברי כנסת בוגרים, במקורות ראשוניים אנושיים (מח עצם – BM – ודם היקפי – PB-) או בתרבויות במבחנה באמצעות פאנל המשלב סמני משטח ספציפיים ולא ספציפיים של MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT ו- CD71, בין היתר). למרות גודלו הגדול ושבריריותו, חברי הכנסת יכולים להיות אימונופנוטיים באמצעות סמני פני התא הנ”ל ומועשרים על ידי מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות בתנאים מסוימים של לחץ וקוטר זרבובית כדי למזער את קרע התא ו /או נזק. טכניקה זו מקלה על גישות multi-Omics, במטרה להבין טוב יותר את המורכבות של megakaryopoiesis וייצור טסיות דם בבריאות האדם ומחלות. ראוי לציין, זה יהיה להוות כלי שימושי כדי לסייע אבחון ופרוגנוזה בהקשר קליני של ביקוש גובר.
בכתב יד זה אנו מתעדים אסטרטגיה לביים מגה-קריופוסיס אנושי עם פאנל המשלב סמני שטח ספציפיים ל- MK ולא ספציפיים ממקורות ראשוניים או שנוצרו במבחנה. בנוסף, אנו מספקים פרוטוקול למיון, עם סדרן תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, השברים המועדפים וחברי הכנסת הבוגרים (איור 1). צעד זה אינו פופולרי, שכן מבחינה טכנית הוא קשה בשל גודלם הגדול ושבריריותם של חברי הכנסת. עם זאת, הוא הועסק הן בדגימות עכבר ומח עצם אנושי בעבר, והן בשל התקדמות טכנולוגית, עם תוצאה טובה יותר בכל פעם16,17,18. מקורות עיקריים אנושיים שבהם ניתן ללמוד חברי כנסת או ח”כים כוללים בין היתר מח עצם, דם טבורי ודם היקפי. העיבוד המדגם הנכון כדי לבודד את שבר התא הרלוונטי לניתוח על כל מדגם הוא בעל חשיבות. נהלים סטנדרטיים משולבים, עם כמה שיקולים לקחת בחשבון כאשר מכוונים לחקר megakaryopoiesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב המחקר המתמקד במחקר של megakaryopoiesis על ידי cytometry זרימה מוגבל עד כה לזיהוי של תת-קבוצות MK באמצעות סמני משטח ספציפיים לשושלת בלבד (כלומר,CD42A/CD42B, CD41/CD61), בעוד שלבי בידול ח”כים קודמים נבדקו בצורה גרועה. במאמר הנוכחי אנו מראים אסטרטגיה אימונופנוטיפינג כדי לטפל אפיון cytometry זרימה מקיפה של מגה-קר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרקוס פרז בסטרצ’ה, לורנה רודריגז לורנצו ובגוניה גרסיה מנדז (HUCA) ופאלומה סרזו, אלמודנה פיירו ומריה דה לה פוודה-קולומו (HCSC) על תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים רפואיים (Roche SP200221001) ל- A.B., מלגת RYC (RYC-2013-12587; השר דה אקונומיה y Competitividad, ספרד) ומענק I+D 2017 (SAF2017-85489-P; השריו דה סינסיה, אוניברסיטת אינבאסיון, ספרד ופונדוס פדר) ללוס אנג’לס, מענק סוורו אוצ’ואה (PA-20-PF-BP19-014; קונסטג’ריוה דה סינסיה, איננובאסיון y אוניברסיטאות דל פרינציפאדו דה אסטוריאס, ספרד) לפ.M.ב. ומענק פוסט-דוקטורט תוך-דורי 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, אוביידו, ספרד) ל- A.A.-H. אנו מודים לרנייה ואן דר לינדן על שיתוף הידע (והזמן שלו), במיוחד עצתו החכמה על תערובת פאנל רב צבעים מתויגים-נוגדנים והכנת בקרת חרוזים בצבע יחיד.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
Riferimenti
- Italiano, J. E. Unraveling Mechanisms That Control Platelet Production. Semin Thrombosis And Haemostasis. 39 (1), 15-24 (2013).
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The Incredible Journey: From Megakaryocyte Development To Platelet Formation. Journal Of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Eckly, A., et al. Biogenesis Of The Demarcation Membrane System (DMS) In Megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Couldwell, G., Machlus, K. R. Modulation Of Megakaryopoiesis And Platelet Production During Inflammation. Thrombosis Research. 179, 114-120 (2019).
- Kosaki, G. In Vivo Platelet Production From Mature Megakaryocytes: Does Platelet Release Occur Via Proplatelets. International Journal Of Hematology. 81 (3), 208-219 (2005).
- Lefrancais, E., Looney, M. R. Platelet Biogenesis In The Lung Circulation. Physiology (Bethesda). 34 (6), 392-401 (2019).
- Nieswandt, B., Stritt, S. Megakaryocyte Rupture For Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 327-328 (2015).
- Nishimura, S., et al. IL-1alpha Induces Thrombopoiesis Through Megakaryocyte Rupture In Response To Acute Platelet Needs. Journal Of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-Biased Stem Cells Reside At The Apex Of The Haematopoietic Stem-Cell Hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Notta, F., et al. Distinct Routes Of Lineage Development Reshape The Human Blood Hierarchy Across Ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
- Yamamoto, R., et al. Clonal Analysis Unveils Self-Renewing Lineage-Restricted Progenitors Generated Directly From Hematopoietic Stem Cells. Cell. 154 (5), 1112-1126 (2013).
- Wang, H., et al. Decoding Human Megakaryocyte Development. Cell Stem Cell. , (2020).
- Meinders, M., et al. Repercussion Of Megakaryocyte-Specific Gata1 Loss On Megakaryopoiesis And The Hematopoietic Precursor Compartment. Plos One. 11 (5), 0154342 (2016).
- Meinders, M., et al. Sp1/Sp3 Transcription Factors Regulate Hallmarks Of Megakaryocyte Maturation And Platelet Formation And Function. Blood. 125 (12), 1957-1967 (2015).
- Salunkhe, V. P., Gutiérrez, L. Culture Of Megakaryocytes From Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. Bio-Protocol. 5 (21), 1639 (2015).
- Choudry, F. A., et al. Transcriptional Characterization Of Human Megakaryocyte Polyploidization And Lineage Commitment. Journal Of Thrombosis And Haemostasis. , 15271 (2021).
- Heazlewood, S. Y., Williams, B., Storan, M. J., Nilsson, S. K. The Prospective Isolation Of Viable, High Ploidy Megakaryocytes From Adult Murine Bone Marrow By Fluorescence Activated Cell Sorting. Methods In Molecular Biology. 1035, 121-133 (2013).
- Tomer, A., Harker, L. A., Burstein, S. A. Purification Of Human Megakaryocytes By Fluorescence-Activated Cell Sorting. Blood. 70 (6), 1735-1742 (1987).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. On The Quest For In Vitro Platelet Production By Re-Tailoring The Concepts Of Megakaryocyte Differentiation. Medicina. 56 (12), (2020).
- Martinez-Botia, P., Acebes-Huerta, A., Seghatchian, J., Gutierrez, L. In Vitro Platelet Production For Transfusion Purposes: Where Are We Now. Transfusion And Apheresis Science. 59 (4), 102864 (2020).
- Butov, K. R., et al. In Vitro Megakaryocyte Culture From Human Bone Marrow Aspirates As A Research And Diagnostic Tool. Platelets. , 1-8 (2020).
- Di Buduo, C. A., et al. A Gold Standard Protocol For Human Megakaryocyte Culture Based On The Analysis Of 1,500 Umbilical Cord Blood Samples. Thrombosis And Haemostasis. , (2020).
