Immunphänotypisierung und Zellsortierung von humanen MKs aus menschlichen Primärquellen oder differenziert in vitro von hämatopoetischen Vorläufern
Summary
Hier stellen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie zur Charakterisierung der Megakaryozytendifferenzierung vor und zeigen, wie diese Strategie die Sortierung von Megakaryozyten in verschiedenen Stadien mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer ermöglicht. Die Methodik kann auf menschliche Primärgewebe, aber auch auf Megakaryozyten angewendet werden, die in Kultur in vitroerzeugt werden.
Abstract
Die Differenzierung von Megakaryozyten (MK) umfasst eine Reihe endobiotischer Zyklen, die zu einer hochgradig polyploiden (sogar >64N reichenden) und extrem großen Zelle (40-60 μm) führen. Im Gegensatz zu dem schnell wachsenden Wissen über Megakaryopoese auf zellbiologischer und molekularer Ebene beschränkt sich die Charakterisierung der Megakaryopoese durch Durchflusszytometrie auf die Identifizierung reifer MKs mit linienspezifischen Oberflächenmarkern, während frühere MK-Differenzierungsstadien unerforscht bleiben. Hier präsentieren wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, die die Identifizierung aufeinanderfolgender MK-Differenzierungsstufen mit zunehmendem Ploidiestatus in menschlichen Primärquellen oder In-vitro-Kulturen mit einem Panel ermöglicht, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker integriert. Trotz ihrer Größe und Zerbrechlichkeit können MKs mit dem oben genannten Panel immunphänotypisiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter bestimmten Druck- und Düsendurchmesserbedingungen angereichert werden. Dieser Ansatz ermöglicht Multi-Omics-Studien mit dem Ziel, die Komplexität der Megakaryopoese und der Thrombozytenproduktion beim Menschen besser zu verstehen. Eine bessere Charakterisierung der Megakaryopoese kann für die Diagnose oder Prognose von abstammungsbedingten Pathologien und Malignitäten von grundlegender Bedeutung sein.
Introduction
Megakaryozyten (MKs) entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) nach einem komplexen Prozess namens Megakaryopoese, der hauptsächlich durch das Hormon Thrombopoietin (TPO) orchestriert wird. Die klassische Sicht der Megakaryopoese beschreibt die zelluläre Reise von HSCs durch eine Abfolge von hierarchischen Stadien engagierter Vorläufer und Vorläuferzellen, die letztendlich zu einem reifen MK führen. Während der Reifung erleben MKs mehrere Runden der Endomitose, entwickeln ein kompliziertes intrazelluläres Demarkationsmembransystem (DMS), das genügend Membranoberfläche für die Thrombozytenproduktion bietet, und produzieren und verpacken effizient die Fülle von Faktoren, die in den verschiedenen Granula enthalten sind, die von reifen Blutplättchen vererbt werden1,2,3. Infolgedessen sind reife MKs große Zellen (40-60 μm), die durch einen stark polyploiden Kern (bis >64N) gekennzeichnet sind. Jüngste Studien schlagen alternative Wege vor, auf denen sich HSCs in MKs differenzieren, die traditionelle Lineage-Commitment-Checkpoints als Reaktion auf bestimmte physiopathologischeBedingungenumgehen 4,5,6,7,8,9,10,11. Diese Ergebnisse zeigen, dass die hämatopoetische Differenzierung zum reifen MK ein Kontinuum und ein adaptiver Prozess ist, der auf biologische Bedürfnisse reagiert.
Mit dem zunehmenden Wissen über die Zellbiologie und die molekularen Aspekte, die die Megakaryopoese12charakterisieren, beschränkt sich der Großteil der Forschung, die der Untersuchung des Prozesses durch Durchflusszytometrie gewidmet ist, auf die Identifizierung reifer MKs mit linienspezifischen Oberflächenmarkern(d. H. CD42A / B, CD41 / CD61), während frühere MK-Differenzierungsstadien unerforscht bleiben. Wir haben zuvor eine Strategie zur Inszenierung der Megakaryopoese in Mausknochenmark und knochenmarkabgeleiteten MK-Kulturen13,14dokumentiert, die wir angepasst und auf den Menschen angewendet haben15. Im vorliegenden Artikel zeigen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, die die Charakterisierung der Megakaryopoese von HSCs bis hin zu reifen MKs in menschlichen Primärquellen (Knochenmark -BM- und peripheres Blut -PB-) oder in vitro-Kulturen unter Verwendung eines Panels ermöglicht, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker (u.a. CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT und CD71) integriert. Trotz ihrer größe und Zerbrechlichkeit können MKs mit den oben genannten Zelloberflächenmarkern immunphänotypisiert und durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung unter bestimmten Druck- und Düsendurchmesserbedingungen angereichert werden, um Zellrupturen und / oder Schäden zu minimieren. Diese Technik ermöglicht Multi-Omics-Ansätze mit dem Ziel, die Komplexität der Megakaryopoese und der Thrombozytenproduktion in der menschlichen Gesundheit und Krankheit besser zu verstehen. Bemerkenswert ist, dass es sich als nützliches Werkzeug zur Unterstützung der Diagnose und Prognose in einem klinischen Kontext wachsender Nachfrage ässt.
In diesem Manuskript dokumentieren wir eine Strategie zur Inszenierung der menschlichen Megakaryopoese mit einem Panel, das MK-spezifische und unspezifische Oberflächenmarker aus Primärquellen integriert oder in vitroerzeugt. Zusätzlich stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, um mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer die bevorzugten Fraktionen und ausgereiften MKs zu sortieren (Abbildung 1). Dieser Schritt ist nicht beliebt, da er aufgrund der Größe und Zerbrechlichkeit von MKs technisch schwierig ist. Es wurde jedoch sowohl in Maus- als auch in menschlichen Knochenmarkproben zuvor und aufgrund des technologischen Fortschritts mit einem besseren Ergebnis jedes Mal16,17,18verwendet. Zu den primären Quellen des Menschen, bei denen MKs oder MK-Vorläufer untersucht werden können, gehören unter anderem Knochenmark, Nabelschnurblut und peripheres Blut. Die richtige Probenverarbeitung, um die relevante Zellfraktion für die Analyse an jeder Probe zu isolieren, ist von Bedeutung. Standardverfahren werden integriert, wobei einige Überlegungen zu berücksichtigen sind, wenn es um die Untersuchung der Megakaryopoese geht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der größte Teil der Forschung, die sich auf die Untersuchung der Megakaryopoese mittels Durchflusszytometrie konzentriert, beschränkt sich bisher auf die Identifizierung von MK-Untergruppen, die nur linienspezifische Oberflächenmarker(d. H.CD42A / CD42B, CD41 / CD61) verwenden, während frühere MK-Differenzierungsstadien schlecht untersucht wurden. Im vorliegenden Artikel zeigen wir eine Immunphänotypisierungsstrategie, um eine umfassende durchflusszytometrische Charakterisierung der menschlichen Megakaryo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo und Begoña García Méndez (HUCA) sowie Paloma Cerezo, Almudena Payero und María de la Poveda-Colomo (HCSC) für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch Medical Grants (Roche SP200221001) an A.B., ein RYC-Stipendium (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) und einem I+D 2017 Grant (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Spanien und Fondos FEDER) an L.G., ein Severo Ochoa Grant (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Asturias, Spanien) bis P.M.-B. und ein intramurales Postdoc-Stipendium 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Asturias – FINBA, Oviedo, Spanien) an A.A.-H. Wir danken Reinier van der Linden für den Austausch seines Wissens (und seiner Zeit), insbesondere seiner klugen Ratschläge zur mehrfarbigen Mischung aus markierten Antikörpern und zur Vorbereitung der einfarbigen Perlenkontrolle.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
Riferimenti
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