Imunofenoftipagem e Triagem celular de MKs humanos de fontes primárias humanas ou in vitro diferenciados de progenitores hematopoiéticos
Summary
Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping para a caracterização da diferenciação de megacaitos, e mostramos como essa estratégia permite a classificação de megacaiócitos em diferentes estágios com um classificador celular ativado pela fluorescência. A metodologia pode ser aplicada aos tecidos primários humanos, mas também aos megacaitos gerados na cultura in vitro.
Abstract
A diferenciação de megacariócito (MK) abrange uma série de ciclos endomitóticos que resultam em uma célula altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N) e extremamente grande (40-60 μm). Ao contrário do rápido crescimento do conhecimento em megacaripoiesis na biologia celular e no nível molecular, a caracterização da megacariopoiese por citometria de fluxo limita-se à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos da linhagem, enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Aqui, apresentamos uma estratégia de imunofenofoteping que permite a identificação de estágios sucessivos de diferenciação de MK, com status ploidy crescente, em fontes primárias humanas ou culturas in vitro com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK. Apesar de seu tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando o painel acima mencionado e enriquecidos pela triagem celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal. Essa abordagem facilita estudos multi-Omics, com o objetivo de entender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas em humanos. Uma melhor caracterização da megacaritopoiese pode representar fundamental no diagnóstico ou prognóstico de patologias e malignidade relacionadas à linhagem.
Introduction
Os megacariócitos (MKs) desenvolvem-se a partir de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) seguindo um processo complexo chamado megacariiopoiese, que é orquestrado principalmente pelo hormônio trombopoietina (TPO). A visão clássica da megacaripoiese descreve a jornada celular dos HSCs através de uma sucessão de estágios hierárquicos de progenitores comprometidos e células precursoras, levando finalmente a um MK maduro. Durante a maturação, os MKs experimentam múltiplas rodadas de endomitose, desenvolvem um intrincado sistema de membrana intracelular (DMS), que fornece superfície de membrana suficiente para a produção de plaquetas, e produzem e embalam eficientemente a infinidade de fatores que estão contidos nos diferentes grânulos herdados pelas plaquetas maduras1,2,3. Como resultado, MKs maduros são células grandes (40-60 μm) caracterizadas por um núcleo altamente poliploide (atingindo até mesmo >64N). Estudos recentes sugerem rotas alternativas pelas quais os HSCs se diferenciam em MKs contornando os pontos de verificação tradicionais de compromisso de linhagem em resposta a certas condições fisio-patológicas4,5,6,7,8,9,10,11. Esses achados destacam que a diferenciação hematopoiética em relação ao MK maduro é um processo contínuo e adaptativo que responde às necessidades biológicas.
Com o crescente conhecimento sobre a biologia celular e os aspectos moleculares caracterizando a megacariopoiese12, a maioria das pesquisas dedicadas ao estudo do processo por citometria de fluxo estão limitadas à identificação de MKs maduros usando marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja, CD42A/B, CD41/CD61), enquanto os estágios anteriores de diferenciação de MK permanecem inexplorados. Documentamos anteriormente uma estratégia para encenar megacaripoiesis em medula óssea de camundongos e culturas MK derivadas da medula óssea13,14, que adaptamos e aplicamos aos humanos15. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteca que permite a caracterização da megacariiopoiese, dos HSCs aos MKs maduros, em fontes primárias humanas (medula óssea -BM e sangue periférico -PB-) ou culturas in vitro utilizando um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos MK (CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT e CD71, entre outros). Apesar de seu grande tamanho e fragilidade, os MKs podem ser imunofenótipados usando os marcadores de superfície celular acima mencionados e enriquecidos pela classificação celular ativada pela fluorescência em condições específicas de pressão e diâmetro do bocal para minimizar a ruptura celular e/ou danos. Essa técnica facilita abordagens multi-Omics, com o objetivo de compreender melhor a complexidade da megacariopoiese e da produção de plaquetas na saúde humana e na doença. Vale ressaltar que será uma ferramenta útil para auxiliar o diagnóstico e o prognóstico em um contexto clínico de crescente demanda.
Neste manuscrito documentamos uma estratégia para encenar megacaripoiesis humanas com um painel integrando marcadores de superfície específicos e não específicos de MK de fontes primárias ou gerados in vitro. Além disso, fornecemos um protocolo para classificar, com um classificador celular ativado por fluorescência, as frações preferidas e MKs maduros(Figura 1). Este passo não é popular, pois é tecnicamente difícil devido ao grande tamanho e fragilidade dos MKs. No entanto, tem sido empregado tanto em amostras de camundongos quanto de medula óssea humana anteriormente, e devido ao avanço tecnológico, com melhor resultado a cada vez16,17,18. Fontes primárias humanas onde mks ou precursores mk podem ser estudados incluem medula óssea, sangue do cordão umbilical e sangue periférico, entre outros. O processamento adequado da amostra para isolar a fração celular relevante para análise em cada amostra é de importância. Os procedimentos padrão são incorporados, com algumas considerações a serem consideradas ao mirar no estudo da megacaripoiese.
Protocol
Representative Results
Discussion
A maior parte da pesquisa com foco no estudo da megacariopoiese por citometria de fluxo é até hoje limitada à identificação de subconjuntos MK usando apenas marcadores de superfície específicos de linhagem (ou seja,CD42A/CD42B, CD41/CD61), enquanto estágios anteriores de diferenciação de MK foram mal examinados. No presente artigo mostramos uma estratégia de imunofenofoteping para abordar uma caracterização abrangente da citometria de fluxo da megacariopoiese humana. No geral, gostaríamos de destac…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Marcos Pérez Basterrechea, Lorena Rodríguez Lorenzo e Begoña García Méndez (HUCA) e Paloma Cerezo, Almudena Payero e María de la Poveda-Colomo (HCSC) pelo apoio técnico. Este trabalho foi parcialmente apoiado por Bolsas Médicas (Roche SP200221001) para A.B., uma bolsa da RYC (RYC-2013-12587; Ministerio de Economía y Competitividad, Espanha) e uma subvenção I+D 2017 (SAF2017-85489-P; Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades, Espanha e Fondos FEDER) para L.G., um Subsídio Severo Ochoa (PA-20-PF-BP19-014; Consejería de Ciencia, Innovación y Universidades del Principado de Astúrias, Espanha) para P.M.-B. e uma bolsa de pós-doutorado intramuros 2018 (Fundación para la Investigación y la Innovación Biosanitaria de Astúrias – FINBA, Oviedo, Espanha) para A.A.-H. Agradecemos a Reinier van der Linden por compartilhar seu conhecimento (e tempo), especialmente seus sábios conselhos sobre a mistura de painel de anticorpos com várias cores e a preparação do controle de contas de cor única.
Materials
| 130 micron Nozzle | BD | 643943 | required for MK sorting |
| 5810R Centrifuge | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| A-4-62 Swing Bucket Rotor | Eppendorf | Cell isolation and washes | |
| Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge | ELITech Group | Automatized cytology devise, where slides are stained with Mat-Grünwald Giemsa | |
| CO2 Incubator Galaxy 170 S | Eppendorf | Cell Incubation | |
| Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermo Scientific | To prepare cytospins | |
| FACSAria IIu sorter | BD | Lasers 488-nm and 633-nm | |
| FACSCanto II flow cytometer | BD | Lasers 488-nm , 633-nm and 405-nm | |
| Olympus Microscope BX 41 | Olympus | Microphotographs | |
| Olympus Microscope BX 61 | Olympus | Microphotographs | |
| Zoe Fluorescent Cell Imager | BioRad | Microphotographs | |
| To obtain PBMCs | |||
| Lipids Cholesterol Rich from adult bovine serum | Sigma-Aldrich | L4646 | or similar |
| Lymphoprep | Stem Cell Technologies | #07801 | or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | or similar |
| Recombinant human Erythropoietin (EPO) | R&D Systems | 287-TC-500 | or similar |
| Recombinant human stem cell factor (SCF) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC2115 | or similar |
| Recombinant human thrombopoietin (TPO) | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | PHC9514 | or TPO receptor agonists |
| StemSpan SFEM | Stem Cell Technologies | #09650 | |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| Bovine Serum Albumin | Merck | A7906-100G | or similar |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | BD | 552843 | Antibodies for human cells are generally from mouse. |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | or similar |
| BD FACS Accudrop Beads | BD | 345249 | |
| CD31 AF-647 | BD | 561654 | Mouse anti-human |
| CD31 FITC | Immunostep | 31F-100T | |
| CD34 FITC | BD | 555821 | Mouse anti-human |
| CD41 PE | BD | 555467 | Mouse anti-human |
| CD41 PerCP-Cy5.5 | BD | 333148 | Mouse anti-human |
| CD42A APC | Immunostep | 42AA-100T | We observed unspecific binding… that needs to be assessed |
| CD42A PE | BD | 558819 | Mouse anti-human |
| CD42B PerCP | Biolegend | 303910 | Mouse anti-human |
| CD49B PE | BD | 555669 | Mouse anti-human |
| CD61 FITC | BD | 555753 | Mouse anti-human |
| CD71 APC-Cy7 | Biolegend | 334109 | Mouse anti-human |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564219 | Fc blocking – control |
| KIT PE-Cy7 | Biolegend | 313212 | Mouse anti-human |
| Lineage Cocktail 2 FITC | BD | 643397 | Mouse anti-human |
| RNAse | Merck | R6513 | or similar |
| Triton X-500 | Merck | 93443-500ML | or similar |
| Cell strainers for sorting | |||
| CellTrics Filters 100 micrometers | Sysmex | 04-004-2328 | Cell strainers |
| Note: we do not specify general reagents/chemicals (PBS, EDTA, etc) or disposables (tubes, etc), or reagents specified in previous published and standard protocols – unless otherwise specified. | |||
Riferimenti
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