تقييم الاستجابات المناعية التنفسية للمستدمية النزلية
Summary
المستدمية النزلية تحفز الالتهاب في الجهاز التنفسي. ستركز هذه المقالة على استخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر لتحديد الاستجابات المناعية بواسطة الخلايا البلعمية والخلايا الليمفاوية استجابة لهذه البكتيريا.
Abstract
المستدمية النزلية (Hi) هي بكتيريا منتشرة توجد في مجموعة من أمراض الجهاز التنفسي. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من المقايسات / التقنيات المختلفة لتقييم الاستجابة المناعية التنفسية / الالتهابية لهذه البكتيريا. قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر هي تقنيات قائمة على التألق تسمح بالتوصيف التفصيلي للاستجابات البيولوجية. يمكن استخدام أشكال مختلفة من مستضد Hi ، بما في ذلك مكونات جدار الخلية ، والمستحضرات المقتولة / المعطلة ، والبكتيريا الحية. Hi هي بكتيريا شديدة الحساسية تتطلب وسائط مخصبة ولكن من السهل عموما أن تنمو في إعدادات المختبر القياسية. يمكن الحصول على عينات الأنسجة للتحفيز باستخدام Hi من الدم المحيطي أو تنظير القصبات أو الرئة المقطوعة (على سبيل المثال ، في المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية لعلاج سرطان الرئة). يمكن تقييم وظيفة البلاعم والعدلات بشكل شامل باستخدام قياس التدفق الخلوي مع مجموعة متنوعة من المعلمات التي تم قياسها ، بما في ذلك البلعمة وأنواع الأكسجين التفاعلية وإنتاج السيتوكين داخل الخلايا. يمكن تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية (على سبيل المثال ، الخلية التائية ووظيفة الخلية القاتلة الطبيعية) على وجه التحديد باستخدام قياس التدفق الخلوي ، بشكل أساسي لإنتاج السيتوكين داخل الخلايا. عدوى Hi هي محفز قوي لإنتاج المصيدة خارج الخلية ، سواء عن طريق العدلات (NETs) أو الضامة (METs). يمكن القول إن الفحص المجهري متحد البؤر هو الطريقة المثلى لتقييم تعبير NET و MET ، والذي يمكن استخدامه أيضا لتقييم نشاط الأنزيم البروتيني. يمكن تقييم مناعة الرئة ضد المستدمية النزلية باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر.
Introduction
المستدمية النزلية (Hi) هي بكتيريا متعايشة طبيعية موجودة في البلعوم لدى معظم البالغين الأصحاء. قد تحتوي Hi على كبسولة عديد السكاريد (الأنواع A-F ، على سبيل المثال ، النوع B أو HiB) أو تفتقر إلى كبسولة وتكون غير قابلة للكتابة (NTHi) 1. يبدأ استعمار الغشاء المخاطي بهذه البكتيريا في مرحلة الطفولة المبكرة ، وهناك دوران لسلالات استعمارية مختلفة2. هذه البكتيريا قادرة أيضا على غزو كل من الجهاز التنفسي العلوي والسفلي. في هذا السياق ، قد يحفز تنشيط الاستجابة المناعية والالتهاب 3,4. قد تسبب هذه الاستجابة الالتهابية مرضا سريريا وتساهم في مجموعة متنوعة من أمراض الجهاز التنفسي المهمة ، بما في ذلك التهاب الجيوب الأنفية والتهاب الأذن الوسطى والتهاب الشعب الهوائية والتليف الكيسي والالتهاب الرئوي ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD). معظم هذه الحالات ناتجة عن سلالات NTHi2. سوف تصف هذه المقالة طرق تقييم الاستجابات المناعية التنفسية ل Hi باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر.
تم تكييف الطرق الموضحة أدناه من التقنيات الراسخة التي تم تعديلها لتقييم الاستجابة الالتهابية ل Hi. يعد اختيار شكل مستضد مناسب من Hi جزءا أساسيا من هذا التقييم. تتراوح المستحضرات المستضدية من مكونات جدار الخلية إلى البكتيريا الحية. لإنشاء وتوحيد المقايسات ، قد يكون استخدام عينات الدم المحيطية مفيدا جدا في البداية.
يتيح قياس التدفق الخلوي قياس مجموعة متنوعة من المعلمات والمقايسات الوظيفية من عينة واحدة على المستوى الخلوي. تتميز هذه التقنية بميزة أنه يمكن تقييم استجابات خلوية محددة (على سبيل المثال ، إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أو إنتاج السيتوكين داخل الخلايا) عند مقارنتها بطرق أخرى أكثر عمومية مثل مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) أو ELISspot.
يتم التعبير عن الفخاخ خارج الخلية بواسطة العدلات (NETs)5،6،7 وبواسطة خلايا أخرى مثل الضامة (METs)8. يتم التعرف عليها بشكل متزايد كاستجابة التهابية رئيسية ، لا سيما في العدوى في الرئة9. يمكن تقييمها عن طريق الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. تسمح هذه التقنية بالتحديد النهائي لشبكات / METs وتميز تعبيرها عن الأشكال الأخرى لموت الخلايا6.
كل من قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري متحد البؤر عبارة عن مقايسات قائمة على التألق. يعتمد نجاحها على بروتوكولات الإجهاد المثلى للعينات البيولوجية. تستغرق هذه الأساليب بعض الوقت للتعلم وتتطلب خبرة إشرافية مناسبة. الأدوات المعنية هي أيضا مكلفة على حد سواء لشراء وتشغيل. يشمل الإعداد الأمثل لاستخدامها الجامعات الكبرى ومستشفيات الإحالة من الدرجة الثالثة.
الطرق المستخدمة في هذا البروتوكول قابلة للنقل لدراسة الكائنات الحية المماثلة الأخرى المشاركة في أمراض الجهاز التنفسي (على سبيل المثال ، Moxarella catarrhalis والعقدية الرئوية). NTHi يتفاعل أيضا مع بكتيريا الجهاز التنفسي الشائعة الأخرى10.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستخدم الطرق المذكورة هنا قياس التدفق الخلوي القائم على التألق وتقنيات الفحص المجهري متحد البؤر التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب للحصول على معلومات مفصلة حول استجابة الرئة الالتهابية ل Hi.
يعد إنشاء الصيغة المستضدية المناسبة ل Hi لاستخدامها أمرا بالغ الأهمية ، ومن المستحسن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا موظفي علم المناعة السريرية في Monash Health على مساعدتهم في هذا العمل.
Materials
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 213330 | |
| Brefeldin | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| Filcon sterile nylon mesh | Becton Dickinson | 340606 | |
| Gelatin substrate, Enzchek | Molecular probes | E12055 | |
| MACS mix tube rotater | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | Catalogue number not available | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost slides | Thermofisher | 11562203 |
References
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections. Harrisons Principles of Internal Medicine. 152, (2018).
- King, P. T., Sharma, R. The lung immune response to nontypeable haemophilus influenzae (lung immunity to NTHi). Journal of Immunology Research. , 706376 (2015).
- Ahearn, C. P., Gallo, M. C., Murphy, T. F. Insights on persistent airway infection by non-typeable Haemophilus influenzae in chronic obstructive pulmonary disease. Pathogens and Disease. 75, 9 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. Journal of Cell Biology. 198, 773-783 (2012).
- Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nature Medicine. 23, 279-287 (2017).
- Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97, 1023-1035 (2015).
- Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers in Immunology. 4, 1 (2013).
- Jacobs, D. M., Ochs-Balcom, H. M., Zhao, J., Murphy, T. F., Sethi, S. Lower airway bacterial colonization patterns and species-specific interactions in chronic obstructive pulmonary disease. Journal of Clinical Microbiology. 56, (2018).
- Barenkamp, S. J., Munson, R. S., Granoff, D. M. Subtyping isolates of Haemophilus influenzae type b by outer-membrane protein profiles. The Journal of Infectious Diseases. 143, 668-676 (1981).
- Barenkamp, S. J. Outer membrane proteins and lipopolysaccharides of nontypeable Haemophilus influenzae. The Journal of Infectious Diseases. 165, 181-184 (1992).
- Johnston, J. W. Laboratory growth and maintenance of Haemophilus influenzae. Current Protocols in Microbiology. , (2010).
- King, P. T., et al. Adaptive immunity to nontypeable Haemophilus influenzae. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 587-592 (2003).
- Coleman, H. N., Daines, D. A., Jarisch, J., Smith, A. L. Chemically defined media for growth of Haemophilus influenzae strains. Journal of Clinical Microbiology. 41, 4408-4410 (2003).
- King, P. T., Ngui, J., Gunawardena, D., Holmes, P. W., Farmer, M. W., Holdsworth, S. R. Systemic humoral immunity to non-typeable Haemophilus influenzae. Clinical & Experimental Immunology. 153, 376-384 (2008).
- King, P. T., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression. PLoS One. 10, 0120371 (2015).
- Aaron, S. D., et al. Granulocyte inflammatory markers and airway infection during acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163, 349-355 (2001).
- King, P. T., et al. Lung T-cell responses to nontypeable Haemophilus influenzae in patients with chronic obstructive pulmonary disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131, 1314-1321 (2013).
- Tsujikawa, T., et al. Robust cell detection and segmentation for image cytometry reveal th17 cell heterogeneity. Cytometry A. 95, 389-398 (2019).
- Sharma, R., O’Sullivan, K. M., Holdsworth, S. R., Bardin, P. G., King, P. T. Visualizing macrophage extracellular traps using confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56459 (2017).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Ueckert, J. E., Nebe von-Caron, G., Bos, A. P., ter Steeg, P. F. Flow cytometric analysis of Lactobacillus plantarum to monitor lag times, cell division and injury. Letters in Applied Microbiology. 25, 295-299 (1997).
- Essilfie, A. T., et al. Combined Haemophilus influenzae respiratory infection and allergic airways disease drives chronic infection and features of neutrophilic asthma. Thorax. 67, 588-599 (2012).
- Huvenne, W., et al. Exacerbation of cigarette smoke-induced pulmonary inflammation by Staphylococcus aureus enterotoxin B in mice. Respiratory Research. 12, 69 (2011).
- Radhakrishna, N., Farmer, M., Steinfort, D. P., King, P. A Comparison of Techniques for Optimal Performance of Bronchoalveolar Lavage. Journal of Bronchology & Interventional Pulmonology. 22, 300-305 (2015).
- Quatromoni, J. G., Singhal, S., Bhojnagarwala, P., Hancock, W. W., Albelda, S. M., Eruslanov, E. An optimized disaggregation method for human lung tumors that preserves the phenotype and function of the immune cells. Journal of Leukocyte Biology. 97, 201-209 (2015).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American thoracic society workshop report. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 61, 150-161 (2019).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11, 0150606 (2016).
- Duan, M., et al. Distinct macrophage subpopulations characterize acute infection and chronic inflammatory lung disease. Journal of Immunology. 189, 946-955 (2012).
