Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie
Summary
We introduceren hier een procedure om eiwit oligomeren en aggregatie in cellysaat en levende cellen te meten met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie.
Abstract
Eiwitaggregatie is een kenmerk van neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (ZvH), enzovoort. Om oplosbare of diffuse eiwit oligomeren of aggregaten te detecteren en te analyseren, is fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS) gebruikt, die de diffusiesnelheid en helderheid van een enkel deeltje met een enkele molecuulgevoeligheid kan detecteren. De juiste procedure en knowhow voor de detectie van eiwitaggregatie zijn echter niet op grote schaal gedeeld. Hier tonen we een standaardprocedure van FCS-meting voor diffusie-eigenschappen van aggregatiegevoelige eiwitten in cellysaat en levende cellen: ALS-geassocieerd 25 kDa carboxyl-terminal fragment van TAR DNA/RNA-bindend eiwit 43 kDa (TDP25) en superoxide dismutase 1 (SOD1). De representatieve resultaten tonen aan dat een deel van de aggregaten van groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld TDP25 enigszins was opgenomen in de oplosbare fractie van murien neuroblastoom Neuro2a cellysaat. Bovendien toont GFP-gelabelde SOD1 met ALS-geassocieerde mutatie een langzamere diffusie in levende cellen. Dienovereenkomstig introduceren we hier de procedure om de eiwitaggregatie via de diffusie-eigenschap ervan te detecteren met behulp van FCS.
Introduction
Eiwitaggregaties met neurodegeneratieve aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, de ziekte van Huntington, enzovoort1 zijn bekend als giftig en zouden de eiwithomeostase (proteostase) in de cellen en organen verstoren, wat dan kan leiden tot veroudering2. De klaring van eiwitaggregatie wordt verwacht als een therapeutische strategie; chemische stoffen die eiwitaggregatievorming voorkomen en eiwitaggregaten afbreken (bijv. kleine moleculen of geneesmiddelen) zijn echter nog niet vastgesteld. Bovendien blijft de manier waarop eiwitaggregatie toxiciteit uitoefent ongrijpbaar. Daarom is het belangrijk om, om onderzoeksprojecten met betrekking tot eiwitaggregatie te bevorderen, procedures met een hoge doorvoer in te voeren om eenvoudig eiwitaggregatie te detecteren. Eiwitaggregatiedetectie met behulp van antilichamen die de conformatie van eiwitaggregatie en aggregatiespecifieke fluorescerende kleurstof herkennen, is veel gebruikt3. Het is echter moeilijk om de aggregatie te detecteren, vooral in levende cellen met behulp van dergelijke klassieke procedures.
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een procedure om eiwitaggregatie en structurele verandering te detecteren. FRET is echter niet in staat om eiwitdynamiek te analyseren (bijv. diffusie en oligomerisatie van eiwitten in levende cellen)3. Daarom introduceren we hier een eenvoudig protocol om eiwitaggregatie in oplossing (bijv. cellysaat) en levende cellen te detecteren met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie (FCS), die de diffusie-eigenschap en helderheid van fluorescerende moleculen met één molecuulgevoeligheidmeet 4. FCS is een fotontellingsmethode met behulp van een laserscan confocale microscoop (LSM). Met behulp van een zeer gevoelige fotondetector en berekening van de autocorrelatiefunctie (ACF) van de aankomsttijd van foton wordt de passeertijd en helderheid van de fluorescerende moleculen in het detectievolume gemeten. De diffusie vertraagt met een toename van het molecuulgewicht; zo kan intermoleculaire interactie worden geschat met behulp van FCS. Sterker nog, een toename van de helderheid van het fluorescerende molecuul duidt op homo-oligomerisatie van de moleculen. Daarom is FCS een krachtig hulpmiddel om een dergelijke eiwitaggregatie te detecteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wat de systeemkalibratie vóór de metingen betreft, moet hetzelfde glaswerk worden gebruikt als het glaswerk dat wordt gebruikt om het monster te meten (bv. de 8-putten bedekken de glazen kamer voor cellysaat en de glazen basisschaal van 35 mm voor levende cellen). Door de adsorptie van Rh6G op het glas kan de effectieve concentratie soms afnemen. Als dat het gevolg is, moet een sterk geconcentreerde Rh6G-oplossing zoals 1 μM alleen voor de pinhole-aanpassing worden gebruikt. Extreem hoge fotontellingen moeten worden v…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. werd ondersteund door een Japan Society for Promotion of Science (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), door een grant-in-aid van de Nakatani Foundation for Countermeasures against novel coronavirus infections, door een subsidie van Hokkaido University Office for Developing Future Research Leaders (L-Station) en een grant-in-aid van Hoansha Foundation. M. K. werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems” (#20H04686) en een JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas “Information physics of living matters” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Riferimenti
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
