איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי
Summary
אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.
Abstract
צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS), מחלת אלצהיימר (לספירה), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), וכן הלאה. כדי לזהות ולנתח אוליגומרים או אגרגטים של חלבונים מסיסים או מפוזרים, נעשה שימוש בספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS), שיכולה לזהות את מהירות הדיפוזיה והבהירות של חלקיק יחיד עם רגישות למולקולות בודדות. עם זאת, ההליך הנכון והידע לגילוי צבירת חלבונים לא שותפו באופן נרחב. כאן, אנו מראים הליך סטנדרטי של מדידת FCS עבור מאפייני דיפוזיה של חלבונים נוטים לצבירה בתאים ליזאטים חיים: ALS הקשורים 25 kDa קרבוקסיל-מסוף שבר של TAR DNA / RNA מחייב חלבון 43 kDa (TDP25) ו סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). התוצאות הייצוגיות מראות כי חלק אגרגטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מתויג TDP25 נכלל מעט בחלק מסיס של neuroblastoma מורין Neuro2a תא lysate. יתר על כן, GFP מתויג SOD1 נושאת מוטציה הקשורה ALS מראה דיפוזיה איטית יותר בתאים חיים. בהתאם לכך, אנו מציגים כאן את ההליך לגילוי צבירת החלבון באמצעות נכס הדיפוזיה שלו באמצעות FCS.
Introduction
צבירות חלבון המערבות הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, וכן הלאה1 ידועים להיות רעילים יפריע הומאוסטזיס חלבון (פרוטוסטזיס) בתאים ובאיברים, זה יכול אז להוביל להזדקנות2. אישור צבירת החלבון צפוי כאסטרטגיה טיפולית; עם זאת, כימיקלים המונעים היווצרות צבירת חלבונים ואגרגטים של חלבונים משפילים (למשל, מולקולות קטנות או תרופות) עדיין לא הוקמו. יתר על כן, איך צבירת חלבון מפעיל רעילות נשאר חמקמק. לכן, כדי לקדם פרויקטים מחקריים הקשורים לצבירת חלבונים, חשוב להציג נהלי תפוקה גבוהים פשוט כדי לזהות צבירת חלבונים. גילוי צבירת חלבונים באמצעות נוגדנים המזהים את ההתאמה של צבירת חלבונים וצבירה ספציפית לצבירה צבע פלואורסצנטי כבר בשימוש נרחב3. עם זאת, קשה לזהות את הצבירה, במיוחד בתאים חיים באמצעות הליכים קלאסיים כאלה.
העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET) היא הליך לגילוי צבירת חלבונים ושינוי מבני. עם זאת, FRET אינו מסוגל לנתח את דינמיקת החלבון (למשל, דיפוזיה ואוליגומריזציה של חלבון בתאים חיים)3. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול פשוט לזיהוי צבירת חלבונים בתמיסה (למשל, ליזלת תאים) ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות (FCS), המודדת את מאפיין הדיפוזיה והבהירות של מולקולות פלואורסצנטיות עם רגישות למולקולותבודדות 4. FCS היא שיטת ספירת פוטון באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל סריקת לייזר (LSM). באמצעות גלאי פוטון רגיש מאוד וחישוב של פונקציית התיקון האוטומטי (ACF) של זמן ההגעה של פוטון, המעבר בזמן ובבהירות של מולקולות הפלואורסצנט בנפח הגילוי נמדד. הדיפוזיה מאטה עם עלייה במשקל מולקולרי; לכן, אינטראקציה בין מולקולרית ניתן להעריך באמצעות FCS. אפילו יותר בעוצמה, עלייה בבהירות של מולקולת הפלואורסצנט מצביעה על הומו-אוליגומריזציה של המולקולות. לכן, FCS הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות צבירת חלבון כזה.
Protocol
Representative Results
Discussion
לגבי כיול המערכת לפני המדידות, יש להשתמש באותן כלי זכוכית המשמשים למדידת הדגימה (למשל, 8 הבארות מכסות תא זכוכית עבור ליזלת תאים ותבשיל בסיס זכוכית 35 מ”מ לתאים חיים). בגלל ספיחה של Rh6G על הזכוכית, הריכוז האפקטיבי שלה עשוי לפעמים להקטין. אם כן, יש להשתמש בתמיסת Rh6G מרוכזת מאוד כגון μM 1 רק להתאמת חו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.K. נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק בסיוע למחקר מדעי (C) (#18K06201), על ידי מענק בסיוע של קרן Nakatani לאופני נגד זיהומים חדשים בנגיף הקורונה, על ידי מענק ממשרד אוניברסיטת הוקאידו לפיתוח מנהיגי מחקר עתידיים (L-Station), ומענק בסיוע מקרן Hoansha. M. K. נתמך חלקית על ידי JSPS Grant-in-Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים “כימיה עבור מערכות ביולוגיות צפיפות רב-מולקולריות” (#20H04686), ומענק JSPS למחקר מדעי על תחומים חדשניים “פיזיקת מידע בענייני חיים” (#20H05522).
Materials
| 0.25% (w/v) Trypsin-1 mmol/L EDTA·4Na Solution with Phenol Red (Trypsin-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| 100-mm plastic dishes | CORNING | 430167 | |
| 35-mm glass base dish | IWAKI | 3910-035 | For live cell measurement |
| 35-mm plastic dishes | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| Aluminum plate | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | Objective | |
| Cell scraper | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | |
| Cellulose acetate filter membrane (0.22 mm) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| Cover glass chamber 8-wells | IWAKI | 5232-008 | For solution measurement |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | basal medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | biosera | Lot check required | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS system | |
| Murine neuroblastoma Neuro2a cells | ATCC | CCL-131 | Cell line |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | Plasmid DNA for the transfection carrier |
| Penicillin-Streptomycin Solution (×100 ) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | Plasmid DNA for TDP25 tagged with monomeric eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | Plasmid DNA for eGFP monomer expression | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | Plasmid DNA for ALS-linked G85R mutant of SOD1 tagged with monomeric eGFP | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8304 |
Riferimenti
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).
- Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques. International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).
- Rigler, R., Mets, U., Widengren, J., Kask, P. Fluorescence Correlation Spectroscopy with High Count Rate and Low-Background – Analysis of Translational Diffusion. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 22 (3), 169-175 (1993).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Kitamura, A., et al. Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity. Scientific Reports. 6, 19230 (2016).
- Kitamura, A., et al. Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1. Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Kitamura, A., et al. Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state. Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).
- Kitamura, A., Shibasaki, A., Takeda, K., Suno, R., Kinjo, M. Analysis of the substrate recognition state of TDP-43 to single-stranded DNA using fluorescence correlation spectroscopy. Biochemistry and Biophysics Reports. 14, 58-63 (2018).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1267-1269 (2011).
- Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1262-1266 (2011).
- Jazani, S., et al. An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy. Nature Communication. 10 (1), 3662 (2019).
- Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs. Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).
- Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS. Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).
- Fujioka, Y., et al. Phase separation organizes the site of autophagosome formation. Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).
- Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions. Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).
- Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells. F1000Research. 9, (2020).
