Kirurgi og prøvebehandling for korrelativ avbildning av murin lungeventilen
Summary
Her beskriver vi en korrelativ arbeidsflyt for eksisjon, trykk, fiksering og avbildning av murinpulmonalventilen for å bestemme bruttokonformasjonen og lokale ekstracellulære matrisestrukturer.
Abstract
De underliggende årsakene til hjerteklaffrelatert sykdom (HVD) er unnvikende. Murine dyremodeller gir et utmerket verktøy for å studere HVD, men den kirurgiske og instrumentelle ekspertisen som kreves for å nøyaktig kvantifisere strukturen og organisasjonen på tvers av flere lengdeskalaer, har hindret utviklingen. Dette arbeidet gir en detaljert beskrivelse av murin disseksjon, en blokkfarging, prøvebehandling og korrelative bildebehandlingsprosedyrer for fremstilling av hjerteklaffen i forskjellige lengdeskalaer. Hydrostatisk transvalvulært trykk ble brukt til å kontrollere den tidsmessige heterogeniteten ved kjemisk å fikse hjerteklaffkonformasjonen. Mikro-beregnet tomografi (μCT) ble brukt til å bekrefte geometrien til hjerteklaffen og gi en referanse for nedstrøms prøvebehandling som trengs for seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM). Høyoppløselige serielle SEM-bilder av den ekstracellulære matrisen (ECM) ble tatt og rekonstruert for å gi en lokal 3D-representasjon av organisasjonen. μCT- og SBF-SEM-avbildningsmetoder ble deretter korrelert for å overvinne den romlige variasjonen på tvers av lungeventilen. Selv om arbeidet som presenteres utelukkende er på lungeventilen, kan denne metoden vedtas for å beskrive den hierarkiske organisasjonen i biologiske systemer og er avgjørende for strukturell karakterisering på tvers av flere lengdeskalaer.
Introduction
Lungeventilen (PV) tjener til å sikre enveis blodstrøm mellom høyre ventrikel og lungearterien. Lungeklaff misdannelser er forbundet med flere former for medfødt hjertesykdom. Den nåværende behandlingen for medfødt hjerteklaffsykdom (HVD) er valvulær reparasjon eller ventilutskifting, noe som kan nødvendiggjøre flere invasive operasjoner gjennom pasientens levetid1. Det har blitt allment akseptert at hjerteklaffens funksjon er avledet fra strukturen, ofte referert til som strukturfunksjonen korrelerer. Mer spesifikt dikterer hjertets geometriske og biomekaniske egenskaper sin funksjon. De mekaniske egenskapene bestemmes i sin tur av sammensetningen og organiseringen av ECM. Ved å utvikle en metode for å bestemme de biomekaniske egenskapene til murine hjerteklaffer, kan transgene dyremodeller brukes til å forhøre ECM-rollen på hjerteklafffunksjon og dysfunksjon2,3,4,5.
Murindyrmodellen har lenge vært ansett som standarden for molekylære studier fordi transgene modeller er lettere tilgjengelige hos mus sammenlignet med andre arter. Murine transgene modeller gir en allsidig plattform for forskning av hjerteklaffrelaterte sykdommer6. Imidlertid har de kirurgiske kompetanse- og instrumenteringskravene for å karakterisere både geometrien og ECM-organisasjonen vært et stort hinder for å utvikle HVD-forskning. Hstologiske data i litteraturen gir et bilde i murin hjerteklaff ekstracellulært matriseinnhold, men bare i form av 2D-bilder, og kan ikke beskrive sin 3D-arkitektur7,8. I tillegg er hjerteklaffen både romlig og tidsmessig heterogen, noe som gjør det vanskelig å trekke konklusjoner på tvers av eksperimenter angående ECM-organisering hvis prøvetaking og konformasjon ikke er løst. Konvensjonelle 3D-karakteriseringsmetoder, for eksempel MR- eller 3D-ekkokardiografi, gir ikke den nødvendige oppløsningen for å løse ECM-komponenter9,10.
Dette arbeidet beskriver en fullstendig korrelativ arbeidsflyt der den tidsmessige heterogeniteten på grunn av hjertesyklusen ble adressert ved å fikse konformasjonen av murin PV med hydrostatisk transvalvulært trykk. Den romlige heterogeniteten ble kontrollert nettopp av prøvetakingsregioner av interesse og registrering av datasett fra forskjellige bildemodaliteter, spesielt μCT og seriell blokk ansiktsskanning elektronmikroskopi, på tvers av forskjellige lengdeskalaer. Denne metoden for speiding med μCT for å lede nedstrøms prøvetaking er foreslått tidligere, men fordi lungeventilen viser tidsvariasjon, var det nødvendig med et ekstra kontrollnivå på kirurgisk nivå11.
In vivo-studier som beskriver murin hjerteklaffbiomekanikk er sparsommelige og er i stedet avhengige av beregningsmodeller når de beskriver deformasjonsatferden. Det er av avgjørende betydning at lokale ekstracellulære data på nanometerlengdeskalaen er relatert til geometrien og plasseringen av hjerteklaffen. Dette gir i sin tur kvantifiserbare, romlig kartlagte distribusjoner av mekanisk medvirkende ECM-proteiner, som kan brukes til å forsterke eksisterende biomekaniske hjerteklaffmodeller12,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fjerning av ventriklene tjener to formål. For det første, utsette ventrikelen side til atmosfærisk trykk, og dermed bare trenger å bruke et transvalvulært trykk fra arteriell side av lungeventilen for å lukke, og for det andre, gir en stabil base for å forhindre vridning av lungestammen. Under trykksetting distendene lungestammen radialt og dårligere, noe som gjør den utsatt for vridning, noe som forårsaker sammenbruddet av lungestammen. Forhåndslasting av lungeventilen med en saltløsning gir en ekstra kvalit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes blant annet av R01HL139796 og R01HL128847 tilskudd til CKB og RO1DE028297 og CBET1608058 for DWM.
Materials
| 25% glutaraldehyde (aq) | EMS | 16210 | Primary fixative component |
| 0.9% sodium chloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 200 proof ethanol | EMS | 15055 | |
| 22G needle | BD | 305156 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 3-way stopcock | Smiths Medical ASD, Inc. | MX5311L | |
| 4% osmium tetroxide | EMS | 19150 | Staining component |
| 4% paraformaldehyde (aq) | EMS | 157-4-100 | Primary fixative component |
| Absorbable hemostat | Ethicon | 1961 | |
| Acetone | EMS | 10012 | |
| Black polyamide monofilament suture, 10-0 | AROSurgical instruments Corporation | TI38402 | |
| Black polyamide monofilament suture, 6-0 | AROSurgical instruments Corporation | SN-1956 | |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | 664 | Approximately 1 yo |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Clamp applying forcep | FST | 00072-14 | |
| Cotton tip applicators | Fisher Scientific | 23-400-118 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dumont #5 forcep | FST | 11251-20 | |
| Dumont #5/45 forceps | FST | 11251-35 | |
| Dumont #7 fine forcep | FST | 11274-20 | |
| Durcupan ACM resin | EMS | 14040 | For embedding |
| Fine scissor | FST | 14028-10 | |
| Heliscan microCT | Thermo Fisher Scientific | Micro-CT | |
| Ketamine hydrochloride injection | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| L-aspartic acid | Sigma-Aldrich | 56-84-8 | Staining component |
| Lead nitrate | EMS | 17900 | Staining component |
| low-vacuum backscatter detector | Thermo Fisher Scientific | VSDBS | SEM backscatter detector |
| Micro-adson forcep | FST | 11018-12 | |
| Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile | EMD Millipore | SLGP033NS | |
| Non-woven songes | McKesson Corp. | 94442000 | |
| Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | 14459-95-1 | Staining component |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 | |
| Pressure monitor line | Smiths Medical ASD, Inc. | MX562 | |
| Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| Size 3 BEEM capsule | EMS | 69910-01 | Embedding container |
| Sodium cacodylate trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-99-3 | Buffer |
| Solibri retractors | FST | 17000-04 | |
| Sputter, carbon and e-beam coater | Leica | EM ACE600 | Gold coater |
| Surgical microscope | Leica | M80 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | EMS | 21900 | Staining component |
| Tish needle holder/forcep | Micrins | MI1540 | |
| Trimmer | Wahl | 9854-500 | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Staining component |
| Volumescope scanning electron microscope | Thermo Fisher Scientific | VOLUMESCOPESEM | Serial Block Face Scanning Electron Microscope |
| Xylazine sterile solution | Akorn Inc. | NADA# 139-236 |
Riferimenti
- Azari, S., et al. A systematic review of the cost-effectiveness of heart valve replacement with a mechanical versus biological prosthesis in patients with heart valvular disease. Heart Failure Reviews. 25 (3), 495-503 (2020).
- Ng, C. M., et al. TGF-β-dependent pathogenesis of mitral valve prolapse in a mouse model of Marfan syndrome. Journal of Clinical Investigation. 114 (11), 1586-1592 (2004).
- Cheek, J. D., Wirrig, E. E., Alfieri, C. M., James, J. F., Yutzey, K. E. Differential activation of valvulogenic, chondrogenic, and osteogenic pathways in mouse models of myxomatous and calcific aortic valve disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 52 (3), 689-700 (2012).
- Jiménez-Altayó, F., et al. Stenosis coexists with compromised α1-adrenergic contractions in the ascending aorta of a mouse model of Williams-Beuren syndrome. Scientific Reports. 10 (1), 889 (2020).
- Thacoor, A. Mitral valve prolapse and Marfan syndrome. Congenital Heart Disease. 12 (4), 430-434 (2017).
- McAnulty, P., Dayan, A., Ganderup, N. -. C., Hastings, K., Dawson, H. A Comparative Assessment of the Pig, Mouse and Human Genomes. The Minipig in Biomedical Research. , (2011).
- Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).
- Hinton, R. B., et al. Extracellular matrix remodeling and organization in developing and diseased aortic valves. Circulation Research. 98 (11), 1431-1438 (2006).
- Sacks, M. S., Merryman, W. D., Schmidt, D. E., David Merryman, D. W., Schmidt, D. E. On the biomechanics of heart valve function. Journal of Biomechanics. 42 (12), 1804-1824 (2009).
- Sacks, M. S., Yoganathan, A. P. Heart valve function: a biomechanical perspective. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 362 (1484), 1369-1391 (2007).
- Morales, A. G., et al. Micro-CT scouting for transmission electron microscopy of human tissue specimens. Journal of Microscopy. 263 (1), 113-117 (2016).
- Sacks, M. S., Smith, D. B., Hiester, E. D. The aortic valve microstructure: Effects of transvalvular pressure. Journal of Biomedical Materials Research. 41 (1), 131-141 (1998).
- Ayoub, S., et al. Heart valve biomechanics and underlying mechanobiology. Comprehensive Physiology. 6 (4), 1743-1780 (2016).
- Stella, J. A., Liao, J., Sacks, M. S. Time-dependent biaxial mechanical behavior of the aortic heart valve leaflet. Journal of Biomechanics. 40 (14), 3169-3177 (2007).
- Korn, E. D., Weisman, R. A. I. loss of lipids during preparation of amoebae for electron microscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. 116 (2), 309-316 (1966).
- Tapia, J. C., et al. High-contrast en bloc staining of neuronal tissue for field emission scanning electron microscopy. Nature Protocols. 7 (2), 193-206 (2012).
- Hinton, R. B., et al. Mouse heart valve structure and function: Echocardiographic and morphometric analyses from the fetus through the aged adult. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2480-2488 (2008).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. Plos Biology. 2 (11), 1900-1909 (2004).
- Lincoln, J., Florer, J. B., Deutsch, G. H., Wenstrup, R. J., Yutzey, K. E. ColVa1 and ColXIa1 are required for myocardial morphogenesis and heart valve development. Developmental Dynamics. 235 (12), 3295-3305 (2006).
- Hamatani, Y., et al. Pathological investigation of congenital bicuspid aortic valve stenosis, compared with atherosclerotic tricuspid aortic valve stenosis and congenital bicuspid aortic valve regurgitation. PLoS One. 11 (8), (2016).
