Protokollen som rapporteras här illustrerar tre alternativa sätt att bedöma prestandan hos genetiskt konstruerade myggor avsedda för vektorkontroll i laboratorieinnehållade små burförsök. Varje protokoll är skräddarsytt för den specifika modifieringen som myggstammen bär (gendrift eller icke-gendrift) och de typer av parametrar som mäts.
Kontroll av myggburna patogener med hjälp av genetiskt modifierade vektorer har föreslagits som ett lovande verktyg för att komplettera konventionella kontrollstrategier. CRISPR-baserade homing gendrivsystem har gjort transgen teknik mer tillgänglig inom det vetenskapliga samfundet. Utvärdering av transgen myggprestanda och jämförelser med vilda motsvarigheter i små laboratoriebursförsök ger värdefulla data för utformningen av efterföljande fältbursexperiment och experimentella bedömningar för att förfina strategierna för förebyggande av sjukdomar. Här presenterar vi tre olika protokoll som används i laboratoriemiljöer för att utvärdera transgene spridning i anopheline mygg vektorer av malaria. Dessa inkluderar översvämmade utgåvor (inget gendrivsystem) och gendrift överlappande och icke-överlappande generationsförsök. De tre försöken varierar i ett antal parametrar och kan anpassas till önskade experimentella inställningar. Dessutom är insektsstudier i små burar en del av den progressiva övergången av konstruerade insekter från laboratoriet till öppna fältutsläpp. Därför utgör de protokoll som beskrivs här ovärderliga verktyg för att tillhandahålla empiriska värden som i slutändan kommer att bidra till genomförandet av ny teknik för malariaeliminering.
Strategier baserade på genetiskt konstruerade myggor eftersträvas för att kontrollera överföringen av vektorburna patogener som de som orsakar malaria1. Dessa inkluderar teknik 1) som syftar till att minska antalet och densiteterna hos Anopheles myggor (populationsdämpning), eller 2) som syftar till att försämra vektorernas förmåga att överföra parasiter som är ansvariga för mänsklig sjukdom (populationsmodifiering, ersättning eller förändring) där stammar av vektorer är konstruerade för att uttrycka effektorgener som förhindrar patogenöverföring. Dessa genetiska metoder har stärkts av tillkomsten av CRISPR/ Cas9-baserade gendrivare, med proofs-of-concept i parasitöverföringsmyggor av effektiv spridning av nyttolastegenskaper samt anti-parasitiska effektormolekyler i burpopulationer.
Små laboratoriebursförsök utgör ett första steg för att utvärdera egenskaperna hos transgena stammar som en del av en stegvis strategi för deras vidare utveckling mot fälttillämpningar2. Specifika resultat överväganden inkluderar ärftlighet av det introducerade DNA i en konkurrensutsatt miljö, penetrance och expressivitet av fenotyp och stabilitet. Relevanta experimentella designfunktioner inkluderar storleken på burarna, myggtätheter, antal replikat, överlappande eller icke-överlappande generationer, åldersstrukturerade målpopulationer, enstaka eller flera utsläpp av konstruerade stammar, endast manliga, kvinnliga eller blandade könsutgivningar, frisättningsförhållanden, blodmjölskällor (artificiella eller levande djur) och screeningförfaranden.
Vi beskriver här protokoll som används för att utvärdera stammar av anofenin myggor för översvämmade utsläpp (inget gendrivsystem) och de som bär autonoma gendrivsystem medierade av Cas9 endonucleases och vägleda RNAs (gRNA). Tillämpning av dessa protokoll förekommer i Pham et al. (2019) 2, Carballar-Lejarazú et al. (2020) 3, och Adolfi et al. (2020) 4.
Översvämmade frisättningsförsök utvärderar spridningshastigheten för en designad transgen under Mendelian arv efter flera utsläpp av ett stort antal transgena myggor i en vild population. Utan att transgenen fästs vid ett drivsystem ger data från översvämmade utgivningsförsök information om lämpligheten och dynamiken hos transgenen av intresse för en stabiliserad befolkning.
När myggpopulationer innehåller ett autonomt gendrivsystem är små burförsök utformade för att bedöma dynamiken i spridningen av önskad transgen genom att bestämma graden av dominerande markörökning efter en enda introduktion av transgena män. Autonoma gendrivarelement bär de gener som kodar Cas9-nukleas, gRNA och dominerande markör som är kopplade på ett sådant sätt att de är aktiva i efterföljande generationer.
Överlappande generationer avser samtidig förekomst av flera generationer i samma bur för att skapa en åldersstrukturerad kontinuerlig population, medan “icke-överlappande” avser enstaka diskreta generationer i varje på varandra följande population i bur2. Gendrivna burexperiment kan avslutas när den ursprungliga dynamiken i enheten (omvandlings) kan bestämmas (8-10 generationer beroende på konstruktionen), och medan de ger information om transgenens kortsiktiga stabilitet inom myggpopulationen, får de inte avslöja vad som händer när och om de dominerande markörfrekvenserna når eller är nära full introduktion (varje mygga som bär minst en kopia av gendrivsystemet).
Genetiskt konstruerade myggor som har patogenblockeringsförmåga eller bär sterilitetsgener utgör nya verktyg för att kontrollera vektorburna sjukdomar. Med tanke på den mångfald av parametrar som omfattar dessa alternativa metoder består ett kritiskt steg i deras forskning av laboratoriebegränsade experimentella utvärderingar som möjliggör en snabb och säker förutsägelse av de potentiella resultaten av en syntetisk transgenfrisättning för kontrolländamål1.
Eftersom övervakningen av transgendynamiken i burpopulationer kan sträcka sig i flera månader, är en av de centrala aspekterna av protokollen konsekvensen i experimentell design mellan replikat (inklusive mygguppfödning, burstorlek, åldersstrukturerade populationer, fasta frisättningsförhållanden, stabila blodmjölskällor och minimalt invasiva screeningförfaranden).
Manliga utsläpp anses vara idealiska eftersom manliga myggor varken överför patogener eller matar på människor, därför kan de säkert införa ärftliga egenskaper i vilda populationer. I laboratoriebursexperiment är det möjligt att upptäcka transgena stammar med minskad manlig parningskonkurrenskraft och andra fitnessbelastningar i samband med transgene integration. Direkta och specifika experiment, som de som utförs i stora burar10, kan dock utföras för att korrekt analysera manlig konkurrenskraft, liksom kvinnlig fecundity i mer naturliga myggtätheter2. Dessutom kan empiriska data från burförsöken användas för att parametrisera modeller av burpopulationsdynamik, inklusive resistent allelbildning, och ge användbar information om effektivitet och möjliga justeringar i den föreslagna tekniken.
De protokoll som beskrivs här kan enkelt anpassas till andra experimentella konstruktioner efter behov, med minimala krav på regelbunden insektsinfrastruktur och förhållanden. Dessutom, förutom de kommersiella burarna och mikroskopen, är de flesta material billiga och tillåter billiga flera replikat och iterationer av försöken. Detta gör det också möjligt att förkontrollera flera transgena stammar i små burförsök för att prioritera att bäst presterande kandidater kan flyttas framåt i den stegvisa testvägen och avbryta testningen av dem som visar suboptimala prestanda.
Slutligen motiverar oron för användningen av genetiskt modifierade organismer utarbetandet av ramar för utveckling, utvärdering och tillämpning av genetiska strategier för förebyggande av myggburna sjukdomar5,8,9. Relevansen och genomförandet av de protokoll som definieras här överensstämmer med dessa riktlinjer.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Drusilla Stillinger, Kiona Parker, Parrish Powell och Madeline Nottoli för mygghållning. Finansieringen tillhandahölls av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ är professor i Donald Bren vid University of California, Irvine.
Artificial feeders | Hemotek | SP6W1-3 | Starter pack – 6 feeders with 3ml reservoirs |
Cage, commercial | BioQuip | 1450D | Collapsible Cage, 24 X 24 X 24" – 0.216 m3 (60 cm3) |
Cage tub (popcorn) | Amazon.com | VP170-0006 | 0.005 m3 (170 fl oz) |
Dissecting microscope with fluorescence light and filters | Leica | M165FC | |
Glue sticks | Michaels | 88646598807 | Gluesticks 40 pk, 0.4X4” |
Hot glue gun | Woodwards Ace | 2382513 | Stanley, 40 watt, GR20 |
Nylon screen (netting) | Joann.com | 1102912 | Tulle 108" Wide x 50 Yds – ~35.6 cm2 (14 in2) |
Oviposition cups | Fisher | 259126 | Beaker PP grad 50 mL |
Razor cutting tool | Office Depot | 487899 | Box cutters |
Scissors | Office Depot | 978561 | Scotch Precision Ultra Edge Titanium Non-Stick Scissors, 8" |
Stapler | Office Depot | 908194 | Swingline Commercial Desk Stapler |
Surgical sleeve (stockinette) | VWR | 56612-664 | ~48 cm (19”) cut from bolt ~15 cm (6”) X ~23 m (25y) |
Zip ties | Home Depot | 295715 | Pk of 100, 14” cable ties – 35.6 cm (14 in) |