Quantificazione della funzione ventricolare sinistra del cuore di topo, del ceppo miocardico e delle forze emodinamiche mediante risonanza magnetica cardiovascolare

Summary

Questo studio descrive un protocollo completo di risonanza magnetica cardiovascolare (CMR) per quantificare i parametri funzionali ventricolari sinistri del cuore del topo. Il protocollo descrive l’acquisizione, la post-elaborazione e l’analisi delle immagini CMR, nonché la valutazione di diversi parametri funzionali cardiaci.

Abstract

I modelli murini hanno contribuito in modo significativo alla comprensione dei fattori genetici e fisiologici coinvolti nella funzione cardiaca sana, di come le perturbazioni provocano patologia e di come le malattie miocardiche possono essere trattate. La risonanza magnetica cardiovascolare (CMR) è diventata uno strumento indispensabile per una valutazione completa in vivo dell’anatomia e della funzione cardiaca. Questo protocollo mostra misurazioni dettagliate della funzione ventricolare sinistra del cuore del topo, del ceppo miocardico e delle forze emodinamiche utilizzando la CMR a 7 Tesla. In primo luogo, vengono dimostrati la preparazione e il posizionamento degli animali nello scanner. Le scansioni di rilevamento vengono eseguite per pianificare sezioni di imaging in varie viste ad asse corto e lungo. Una serie di prospettici filmati ad asse corto (SA) innescati da ECG (o immagini CINE) vengono acquisiti coprendo il cuore dall’apice alla base, catturando le fasi sistolica e diastolica finale. Successivamente, le immagini CINE a fetta singola e retrospettivamente gated vengono acquisite in una vista SA midventricolare e in viste a 2, 3 e 4 camere, per essere ricostruite in immagini CINE ad alta risoluzione temporale utilizzando software personalizzato e open source. Le immagini CINE vengono successivamente analizzate utilizzando un software di analisi delle immagini CMR dedicato.

La delineazione dei confini endomiocardici ed epicardici nelle immagini CINE END-SISTOLICA e DIASTOLICA SA consente il calcolo dei volumi sistolici e diastolici finali, della frazione di eiezione e della gittata cardiaca. Le immagini SA CINE midventricolari sono delineate per tutti gli intervalli di tempo cardiaci per estrarre una curva volume-tempo dettagliata. La sua derivata temporale consente il calcolo della funzione diastolica come rapporto tra il riempimento precoce e le onde di contrazione atriale. Infine, le pareti endocardiche ventricolari sinistre nelle viste a 2, 3 e 4 camere sono delineate utilizzando il feature-tracking, da cui vengono calcolati i parametri di deformazione miocardica longitudinale e le forze emodinamiche ventricolari sinistre. In conclusione, questo protocollo fornisce una quantificazione dettagliata in vivo dei parametri cardiaci del topo, che può essere utilizzata per studiare le alterazioni temporali della funzione cardiaca in vari modelli murini di malattie cardiache.

Introduction

La risonanza magnetica cardiovascolare (CMR) nei piccoli animali fornisce un’accurata misurazione in vivo della funzione miocardica, rendendo la CMR uno strumento ottimale per la ricerca preclinica nelle malattie cardiovascolari. Grazie all’elevata risoluzione spaziale e all’elevato contrasto tra sangue e miocardio nelle immagini CMR, è possibile delineare i contorni endo- ed epicardiali e calcolare la massa miocardica e i volumi ventricolari^1,2. Nonostante le alte frequenze cardiache fino a 600 battiti / min, l’uso dell’elettrocardiogramma (ECG) e dell’innesco respiratorio consente misurazioni di alta qualità di diverse fasi cardiache (chiamate anche immagini CINE) senza artefatti del movimento respiratorio. In questo modo, è possibile utilizzare più fette per coprire il cuore dall’apice alla base per estrarre parametri di funzione sistolica come la frazione di eiezione (EF), il volume sistolico terminale (ESV), il volume diastolico terminale (EDV) e la gittata cardiaca (CO)³. Oltre alla valutazione della funzione sistolica di base, sono state recentemente sviluppate ulteriori tecniche CMR per valutare la disfunzione diastolica^4,il ceppo miocardico⁵e le forze emodinamiche (HDF)^6.

Il gating ECG consente la sincronizzazione con il ciclo cardiaco avviando l’acquisizione del segnale MR dopo il rilevamento del picco R e registrando un numero definito di fasi cardiache durante l’intervallo R-R. Tuttavia, il numero di fasi cardiache (frame rate) che possono essere acquisite in questo modo dipende dal tempo di ripetizione (TR) più basso possibile che il sistema può raggiungere mantenendo un rapporto segnale-rumore accettabile (SNR) e una risoluzione spaziale⁴. Inoltre, poiché l’uso di gradienti di campo magnetico elevati può distorcere temporaneamente il segnale ECG, l’acquisizione viene solitamente interrotta prima della fase diastolica finale. Entrambi i fattori limitano l’uso di tali scansioni alle valutazioni della funzione sistolica, poiché il calcolo di altri parametri funzionali cardiaci richiede una migliore definizione della curva volume-tempo ventricolare sinistro (LV).

Le immagini CINE ad alta frequenza di fotogrammi possono essere acquisite mediante gating retrospettivo, in cui il segnale MR viene acquisito continuamente durante la scansione e un eco navigatore incorporato dopo l’eccitazione a radiofrequenza (RF) rileva il movimento cardiaco e respiratorio. Poiché l’acquisizione CMR viene eseguita in modo asincrono con il movimento cardiaco, i segnali MR acquisiti possono quindi essere assegnati a un numero scelto retrospettivamente di fotogrammi cardiaci. In questo modo, se vengono raccolti dati sufficienti, è possibile ricostruire immagini CINE ad alto frame rate^4,7. Ciò consente quindi una valutazione della funzione diastolica, rappresentata dal rapporto tra il tasso di riempimento precoce di picco (E’) e il tasso di riempimento tardivo di picco dalla contrazione atriale (A’).

Nella ricerca clinica, le immagini CINE possono essere analizzate con il tracciamento delle funzionalità CMR per valutare il ceppo miocardico e HDF^6,8. Il ceppo miocardico è un parametro di deformazione cardiaca che misura la differenza in percentuale tra la lunghezza iniziale (di solito in lunghezza diastolica terminale) e la lunghezza massima (di solito in sistole terminale) di un segmento miocardico⁹. Le misurazioni del ceppo miocardico possono essere di valore incrementale per valutare la funzione LV poiché i valori di deformazione quantificano l’accorciamento e l’ispessimento della parete miocardica. Una riduzione della funzione di accorciamento potrebbe essere un’indicazione di danno alle fibre subendocardiche¹⁰. Alterazioni nel ceppo miocardico possono verificarsi indipendentemente dall’EF e potrebbero essere un precursore delle complicanze sottostanti.

In particolare, il ceppo longitudinale globale (GLS) e il ceppo circonferenziale globale (GCS) hanno dimostrato di essere di valore aggiunto nella caratterizzazione delle malattie cardiache^10,11,12. Allo stesso modo, l’HDF è stato suggerito come un potenziale nuovo parametro per^indicareuna funzione cardiaca^alterata6 ,¹³. Questi HDF o gradienti di pressione interventricolare (IVPG) guidano il movimento sanguigno durante l’espulsione e il riempimento del cuore e sono influenzati dallo scambio di quantità di moto tra sangue e miocardio, compresa la valvola aortica e mitrale^14,15.

In questo studio, viene descritto un protocollo completo per l’esecuzione di robuste misurazioni CMR di piccoli animali per quantificare la funzione LV, il ceppo miocardico e l’HDF dei cuori di topo. Contiene i passaggi necessari per la preparazione degli animali, l’acquisizione dei dati utilizzando immagini CINE del cuore sia prospetticamente che retrospettivamente, nonché l’analisi con software dedicato in grado di calcolare le misurazioni volumetriche, il rapporto E’/A’, il ceppo miocardico e l’HDF del cuore. Questo protocollo può essere utilizzato per la valutazione approfondita della funzione LV in vari modelli murini di malattie cardiovascolari.

Protocol

Gli esperimenti sugli animali descritti sono condotti in conformità con le linee guida dell’Unione Europea per il benessere degli animali da laboratorio (Direttiva 2010/63/UE) e sono stati approvati dall’Academic Medical Center Animal Ethics Committee. 1. Configurazione e preparazione degli animali Prima di iniziare l’esperimento, assicurarsi che ci sia sufficiente anestesia isoflurano per almeno 2 ore e che la batteria disponibile per l’ECG e il monitoraggio respiratorio sia sufficientemente carica. Assicurarsi che l’area dello scanner sia dotata di un tubo di estrazione dei fumi funzionante per rimuovere l’isoflurano in eccesso. Preparare la culla del mouse (Figura 1A) e accendere il sistema di riscaldamento degli animali con la temperatura impostata su 40 °C. Preparare il modulo di interfaccia ECG/respiratoria e la configurazione della batteria (Figura 1B) e avviare il software per il monitoraggio in tempo reale dell’ECG e dei segnali respiratori (Figura 1C). Rimuovere il mouse dalla gabbia dell’alloggiamento e misurare il peso corporeo. Posizionare il mouse in una camera di induzione dell’anestesia sotto un braccio di estrazione della cappa aspirante e fornire il 3-4% di isoflurano in una miscela di 0,2 L / min O2 e 0,2 L / min di aria medica. Dopo che l’animale è completamente anestetizzato, applicare una piccola goccia di unguento per gli occhi su ciascun occhio e chiudere le palpebre del topo. Posizionare il mouse in posizione supina sulla base del mouse. Agganciare gli incisivi del mouse nella barra del morso sulla base del mouse e regolare il cono del naso per adattarlo correttamente (Figura 1A). Controllare visivamente se la respirazione è stabile al di sotto di 100 respiri / min e ridurre l’isoflurano a ~ 2% durante la preparazione degli animali. Spostare la culla del mouse in modo che il cuore si trovi nella parte del supporto della culla che finirà al centro della bobina RF e iso-centro del magnete. Utilizzare vaselina per inserire la sonda di temperatura rettale e collegare il cavo in fibra ottica della sonda di temperatura alla base del mouse. Posizionare il palloncino respiratorio sull’addome inferiore del mouse e fissarlo con del nastro adesivo. Inserire due aghi per elettrodi ECG per via sottocutanea nel torace all’altezza delle zampe anteriori e fissarli delicatamente per impedire il movimento (Figura 1A). Verificare se i segnali respiratori ed ECG sono di qualità sufficiente e se i punti trigger corretti sono rilevati dal software (Figura 1C). Assicurarsi che la frequenza respiratoria sia di 50-80 respiri / min, la frequenza cardiaca ~ 400-600 battiti / min e la temperatura corporea intorno a 37 ° C. Regolare la somministrazione di isoflurano quando la frequenza respiratoria è al di fuori di questo intervallo e ridurre la temperatura del sistema di riscaldamento animale se la temperatura corporea tende a superare i 37 °C. Posizionare la bobina RF sul mouse.NOTA: a seconda del sistema, ciò potrebbe richiedere la disconnessione temporanea degli elettrodi ECG e dei tappi del palloncino respiratorio dal modulo ECG/interfaccia respiratoria. Collegare i cavi della bobina e posizionare la base nel foro del magnete. Controllare se il segnale ECG è ancora stabile. Se il segnale ECG non è ottimale, riposizionare gli elettrodi ECG per un segnale migliore, poiché ciò non può essere fatto in una fase successiva senza modificare significativamente l’orientamento dell’animale. Figura 1: Preparazione degli animali e configurazione delle attrezzature per l’imaging CMR del cuore del topo. (A) Topo completamente anestetizzato in posizione supina, posto nella culla del mouse riscaldata con un cuscino pneumatico respiratorio posto sull’addome, sensore di temperatura a fibre ottiche rettali e cavi ECG sottocutanei nel torace vicino alle zampe anteriori. (B) Bobina del corpo del mouse posizionata sopra la culla del mouse, con cavi ECG e cuscino respiratorio ricollegati all’ECG e all’interfaccia respiratoria prima di posizionare il supporto nel magnete MRI. (C) Rappresentazione dell’ECG e dei segnali respiratori in un software dedicato al monitoraggio dei piccoli animali. Il picco R del segnale ECG viene rilevato e utilizzato come punto di partenza per l’acquisizione del segnale MRI. Un periodo di blanking tra i picchi R può essere regolato manualmente in base al periodo di un battito cardiaco. L’innesco può avvenire solo durante il plateau respiratorio (linea verde nel pannello centrale) per il quale il ritardo iniziale e la larghezza massima possono essere regolati manualmente. Abbreviazioni: CMR = risonanza magnetica cardiovascolare; ECG = elettrocardiogramma; MRI = risonanza magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. Calibrazione e attivazione della scansione MRI Regolare i parametri ECG e respiratori all’interno del software di monitoraggio del segnale in modo tale che i punti trigger vengano generati ai picchi R e solo durante la porzione piatta del segnale respiratorio. Per ridurre al minimo gli errori di gating ECG, impostare un periodo di blanking inferiore di 10-15 ms rispetto all’intervallo R-R.NOTA: questo periodo di blanking deve essere regolato durante l’intero esperimento se si verificano cambiamenti nella frequenza cardiaca. Eseguire una calibrazione della frequenza centrale e una scansione SCOUT standard (non garantita) con offset zero per determinare la posizione del mouse nello scanner in direzioni coronale, assiale e sagittale. Se il cuore non è posizionato entro 0,5-1 cm dal centro del campo visivo (FOV), regolare di conseguenza la posizione della culla e ripetere la scansione SCOUT. Eseguire uno shim manuale e una calibrazione RF utilizzando i metodi disponibili del fornitore. 3. Pianificazione e acquisizione della scansione NOTA: vedere la Tabella 1 per i parametri di scansione dettagliati delle seguenti scansioni. Sulla base dello SCOUT iniziale, eseguire una scansione scout Gradient Echo (GRE) a fotogramma singolo gated(Tabella 1,scansione 1) con 5 fette in 3 direzioni ortogonali e posizionare ogni pila di fette sulla posizione approssimativa del cuore per individuare la posizione esatta del cuore (Figura 2A). Eseguire una scansione scout SA a telaio singolo gated multi-slice(Tabella 1,scansione 2). A tal fine, utilizzare il precedente scout GRE per posizionare 4-5 fette in una posizione ventricolare centrale sinistra, perpendicolare all’asse lungo del cuore per trovare una stima iniziale della vista SA midventricolare, necessaria per pianificare lo scout a 2 camere ad asse lungo (Figura 2B). Per le seguenti scansioni prospettiche (passaggi 3.4-3.6), regolare il numero di fotogrammi cardiaci (Nframes) in modo tale che Nframes × TR sia ~ 60-70% dell’intervallo R-R.NOTA: l’acquisizione per il 60-70% dell’intervallo R-R è sufficiente per catturare la fase diastolica terminale del ciclo cardiaco, consentendo al contempo un ulteriore rilassamento T1 durante la diastole finale per migliorare l’SNR e prevenire il disturbo del successivo picco R mediante commutazione del gradiente. Eseguire una scansione GRE a fetta singola gated per generare lo scout a 2 camere a 2 camere (2CH) ad asse lungo, che combinato con la scansione SA, è necessario per pianificare la 4 camere (4CH)(Tabella 1, scansione 3). A tal fine, posizionate una fetta perpendicolare alle viste SA precedenti che corrono parallele ai punti di connessione tra il ventricolo sinistro e destro. Spostare questa fetta al centro del ventricolo sinistro e controllare l’immagine coronale dello scout GRE se la fetta è allineata con l’asse lungo LV in modo tale da essere posizionata attraverso l’apice (Figura 2C). Eseguire un’altra scansione GRE a fetta singola gated per generare la scansione scout a 4 camere (4CH), necessaria per pianificare la SA multi-slice e la scansione a 3 camere (Tabella 1, scansione 4). A tal fine, posizionare una fetta perpendicolare alla scansione scout 2CH e allinearla al centro dell’asse lungo in modo tale che la fetta passi attraverso la valvola mitrale e l’apice. Nelle viste SA, regolare la fetta in modo che sia posizionata parallelamente alla parete ventricolare posteriore e anteriore e tra i due muscoli papillari (Figura 2D). Controllare se la fetta rimane al centro del ventricolo durante l’intero ciclo cardiaco. Eseguire una scansione SA GRE sequenziale multi-slice gated(Tabella 1,scansione 5) per le misurazioni della funzione sistolica. A tal fine, posizionare una fetta perpendicolare medioventricolare all’asse lungo BT nelle viste 2CH e 4CH al centro del cuore e aumentare il numero di fette (in genere un numero dispari, ad esempio 7 o 9 fette, nessuno spazio tra le fette) per coprire il cuore dalla base all’apice ( Figura2E). Per le seguenti scansioni retrospettivamente chiuse (passaggi 3.8-3.9), disattivare tutte le potenziali funzionalità di gating cardiaco e respiratorio. Prendere nota della frequenza cardiaca e respiratoria prima e dopo ogni scansione retrospettivamente chiusa e utilizzare questi valori per scopi di ricostruzione in seguito (passaggio 5.2.2). Eseguire tre scansioni GRE sequenziali a fetta singola retrospettivamente gated nella vista SA midventricolare (per la quantificazione del rapporto E’/A’), 2CH e 4CH view, le ultime due necessarie per la quantificazione del ceppo miocardico e dei valori HDF(Tabella 1,scansione 6-8). Se necessario, ottimizzare gli orientamenti finali delle sezioni 2CH e 4CH in base alle viste SA multi-slice e alle scansioni scout 2CH e 4CH disponibili. Eseguire un’ulteriore scansione GRE a fetta singola retrospettivamente gated in una vista a 3 camere (3CH), che combinata con la vista 2CH e 4CH dal passaggio 3.8 è necessaria per la quantificazione del ceppo miocardico e dei valori HDF (Tabella 1, scansione 9). A tal fine, posizionare una fetta perpendicolare alla vista SA avventricolare centrale simile alla posizione della vista finale ad asse lungo 4CH e ruotare la fetta di 45° per passare dalla parete anteriore al muscolo papillare più vicino alla parete posteriore. Ispezionare la fetta sa basale per vedere se la fetta passa attraverso la valvola mitrale e aortica. Ispezionare nella vista finale ad asse lungo 4CH se la fetta sta attraversando l’apice (Figura 2F). Figura 2: Pianificazione delle sezioni per l’imaging CMR in un mouse. (A) GRE SCOUT pianificazione attraverso il cuore in 3 viste ortogonali utilizzando la scansione scout iniziale. (B) Pianificazione scout ad asse corto sulle fette coronali e sagittali GRE SCOUT. (C) Pianificazione della vista scout 2CH utilizzando lo scout ad asse corto e la fetta coronale GRE SCOUT. (D) Pianificazione della vista scout 4CH utilizzando lo scout ad asse corto e lo scout 2CH. (E) Pianificazione della vista multi-slice ad asse corto utilizzando scout 2CH e 4CH. (F) (a sinistra) Pianificazione delle viste finali 2CH, 3CH e 4CH utilizzando le viste a corto asse centrale e 2CH/4CH. Abbreviazioni: CMR = risonanza magnetica cardiovascolare; GRE = Eco sfumato; CH = camera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Numero(i) di scansione 1 2 3 4 5 6-9 Nome(i) di scansione Scout GRE scout SA multi-slice Scout 2CH Scout 4CH SA multi-slice SA, 2CH, 4CH, 3CH fette totali 15 (3 x 5)* 4-5 1 1 7-9 1 Spessore (mm) 1 1 1 1 1 1 FOV (millimetro) 60 35 30 30 35 30 Rapporto FOV 1 1 1 1 1 1 Angolo di capovolgimento 40 20 20 20 20 15 TE (ms)** 3.8 3.4 2.5 2.5 2.5 3.6 TR (ms) 200 1 R-R 7 7 7 8 Nframe 1 1 12-14 12-14 12-14 32 *** Dimensione matrice 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 192 x 192 Attivazione ECG No Sì Sì Sì Sì retrospettivo Innesco respiratorio Sì Sì Sì Sì Sì retrospettivo Medie 1 3 5 5 5 retrospettiva **** Tempo totale di imaging (stimato *****) 2 minuti 2 minuti 3-4 minuti 3-4 minuti 20-25 minuti 13 min / scansione Tabella 1: Parametri di acquisizione per ogni sequenza utilizzata durante il protocollo CMR. * Le scansioni vengono eseguite in tre diversi orientamenti ortogonali (assiale, coronale, sagittale). **Il TE più breve possibile, dato che vengono utilizzati tutti gli altri parametri, che dipende dalla configurazione specifica dello scanner. Questo è il numero di fotogrammi cardiaci dopo il binning retrospettivo. La media effettiva dipende dal riempimento casuale dello spazio k durante il tempo totale di acquisizione. In totale, sono state eseguite 400 ripetizioni di tutte le k-line. Compresi i ritardi di innesco ECG / respiratorio. Abbreviazioni: CMR = risonanza magnetica cardiovascolare; ECG = elettrocardiogramma; GRE = eco sfumato; FOV = campo visivo; TE = tempo di eco; TR = tempo di ripetizione; Nframes = numero di fotogrammi cardiaci; SA = asse corto; CH = camera. Fare clic qui per scaricare questa tabella. 4. Finalizzazione dell’esperimento e archiviazione dei dati Rimuovere il mouse dalla base dopo aver staccato tutte le altre apparecchiature di misurazione e spegnere l’anestesia. Nel caso di esperimenti longitudinali, collocare il topo in una gabbia preriscaldata a 37 °C per il recupero fino a quando l’animale non è sveglio e attivo. Pulire tutte le attrezzature che sono state utilizzate con salviette detergenti o alcool al 70%. Genera file DICOM (Digital Imaging and Communication in Medicine) per i dati MRI prospetticamente gated e copiali insieme ai file di dati grezzi MRI delle scansioni retrospettivamente chiuse su un server sicuro per la successiva analisi dei dati. 5. Ricostruzione offline delle scansioni acquisite retrospettivamente NOTA: per la ricostruzione delle scansioni retrospettivamente chiuse, è stato utilizzato un software open source personalizzato (Figura 3). Eseguire separatamente i passaggi seguenti per ciascuno dei dati attivati retrospettivamente. Aprire il software di ricostruzione Retrospectivee caricare il file di dati grezzi corrispondente a una scansione MRI retrospettivamente gated. Ispezionare il segnale del navigatore Raw e notare che i picchi di segnale più alti rappresentano la frequenza respiratoria e i picchi di segnale più bassi rappresentano la frequenza cardiaca. Se i picchi sono registrati a testa in giù, capovolgere il segnale con l’interruttore su/giù. Inoltre, verificare se la frequenza cardiaca rilevata automaticamente corrisponde al 10% dei valori osservati durante ogni scansione. In caso contrario, regolare manualmente questi valori perché il rilevamento automatico non è riuscito. Scegli una percentuale di finestra appropriata per l’esclusione dei dati durante il movimento respiratorio, di solito il 30%. Premere Filtro per eseguire l’analisi del navigatore e separare il navigatore cardiaco dal navigatore respiratorio. Impostare il numero di fotogrammi CINE su 32 (valore utilizzato in questo studio) e premere sort k-space. Scegliere le impostazioni appropriate per la regolarizzazione del rilevamento compresso (CS) e premere Ricostruisci. Utilizzare i seguenti parametri di regolarizzazione tipici: parametro di regolarizzazione wavelet nelle dimensioni spaziali (x, y e z) (WVxyz) 0,001 o 0; vincolo di variazione totale nella dimensione CINE (TVcine) 0,1; vincolo di variazione totale nella dimensione spaziale (TVxyz) 0; e vincolo di variazione totale nella dimensione dinamica (TVdyn) 0,05. Una volta terminata la ricostruzione, visualizza in anteprima il filmato CINE per valutare la ricostruzione. Esporta le immagini DICOM per ulteriori analisi con Export DCM. Figura 3: Interfaccia utente grafica di attivazione “retrospettiva”. ‘Retrospective’ è un’applicazione di ricostruzione personalizzata per scansioni di risonanza magnetica cardiaca attivate retrospettivamente. Nell’interfaccia utente, è possibile valutare il segnale del navigatore, regolare il numero di fotogrammi CINE da ricostruire, regolare i parametri di rilevamento compressi per migliorare la ricostruzione, visualizzare in anteprima le immagini CINE come un filmato dinamico ed esportare i dati ricostruiti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 6. Software di analisi delle immagini NOTA: Il software di analisi delle immagini (Figura 4) richiede l’uso di immagini DICOM e dispone di più plugin per diverse applicazioni di analisi cardiovascolare, come il plugin per le misurazioni volumetriche e il plugin per l’analisi della deformazione e dell’HDF. Per la valutazione volumetrica del LV, selezionare la scansione SA multi-slice e caricarla nel plug-in per le misurazioni volumetriche. Assegnare le etichette end-sistollic (ES) e end-diastolic (ED) al corrispondente frame cardiaco. Utilizzare gli strumenti di contorno per segmentare i bordi endomiocardici nei fotogrammi ES ed ED.NOTA: Il software di analisi, utilizzato per questo protocollo, visualizza automaticamente i parametri LV EF, EDV, ESV quando sono state effettuate tutte le annotazioni necessarie. Per le misurazioni diastoliche, selezionare le immagini SA CINE midventricolari e caricarle nel plug-in per le misurazioni volumetriche. Assegnare le etichette ED ed ES ai fotogrammi cardiaci corrispondenti. Utilizzate gli strumenti di contorno per segmentare il bordo endocardico per tutti i fotogrammi. Confronta la segmentazione dei fotogrammi vicini per garantire transizioni fluide della segmentazione durante tutto il ciclo cardiaco. Esporta l’evoluzione temporale da tutti i fotogrammi cardiaci e dai corrispondenti volumi endomiocardici LV (LV ENDO). Applicare uno script personalizzato (vedere Materiale supplementare)per calcolare il rapporto E’/A’.NOTA: lo script applica un filtro Savitzky-Golay per un calcolo robusto delle curve dV/dt e utilizza il rilevamento semiautomatico dei picchi per trovare i picchi E’ e A’. Per i calcoli di deformazione e HDF, selezionare le immagini CINE a lungo asse 2CH, 3CH e 4CH e caricarle nel plug-in per le misurazioni volumetriche. Assegnate le etichette ED ed ES al fotogramma cardiaco corrispondente in ogni orientamento della sezione. Utilizzate gli strumenti di contorno per segmentare il bordo endocardico per tutti i fotogrammi in tutti e 3 gli orientamenti. Confronta la segmentazione dei fotogrammi vicini per garantire transizioni fluide della segmentazione durante tutto il ciclo cardiaco. Una volta che i contorni sono stati disegnati nel plugin per le misurazioni volumetriche, eseguire il plugin per l’analisi della deformazione e hdF. Assegnare ciascuno dei set di dati acquisiti alle etichette corrispondenti per le viste 2CH, 3CH e 4CH ed eseguire l’analisi della deformazione. Per l’analisi HDF, disegnare il diametro della valvola mitrale sul telaio diastolico terminale in tutti e 3 gli orientamenti e disegnare il diametro dell’aorta nell’immagine ad asse lungo a 3 camere. Figura 4: Interfaccia utente grafica del software di analisi delle immagini. Il plugin per la misurazione volumetrica nel software di analisi delle immagini, che viene utilizzato per il contorno del bordo endomiocardico. Per ogni set di dati, vengono selezionate le fasi cardiache end-diastolic e end-systolic e il bordo endomiocardico è segmentato per tutti i frame. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Utilizzando il protocollo precedentemente descritto, un gruppo di topi wildtype C57BL / 6 sani (n = 6, età 14 settimane) è stato scansionato utilizzando uno scanner MRI a 7 Tesla utilizzando una bobina di gabbia per uccelli di 38 mm di diametro. Durante ogni sessione di scansione, le immagini CINE SA multi-slice sono state acquisite utilizzando sequenze GRE prospetticamente gated, mentre le immagini SA midventricolari a fetta singola, 2CH, 3CH e 4CH sono state acquisite utilizzando il gating retrospettivo. Ricostruzioni rappresentative ad alta frequenza di fotogrammi di scansioni chiuse retrospettivamente utilizzando un software di post-elaborazione personalizzato possono essere visualizzate in Supplemental Video 1. Dalle immagini risultanti sono state determinate le curve volume-tempo durante il ciclo cardiaco (Figura 5A) e le corrispondenti curve della derivata prima (dV/dt) per il calcolo rispettivamente dei parametri sistolici (EF = 72,4 ± 2,8%) e di funzione diastolica (rapporto E’/A’ = 1,5 ± 0,3). Le immagini CINE 2CH, 3CH e 4CH view sono state analizzate utilizzando un software di analisi delle immagini per determinare i cambiamenti GLS endocardici (endoGLS) attraverso il ciclo cardiaco(Figura 5B)e i corrispondenti valori GLS di picco (-22,8 ± 2,4%) come misura per il ceppo miocardico. Inoltre, il software calcola l’HDF quadrato medio della radice (RMS) in direzioni longitudinale (apice-base) (135,2 ± 31,7%) e trasversale (inferolaterale-anteroroseptale) (12,9 ± 5,0%). Per ogni animale, è anche possibile produrre un profilo temporale HDF, che segue uno schema coerente di picchi positivi e negativi che rappresentano l’entità e la direzione dell’HDF durante il ciclo cardiaco (Figura 5C). I risultati descrittivi di tutti i parametri di risultato sono riepilogati nella Figura 5D. Figura 5: Quantificazione dei parametri funzionali LV in base al cuore del mouse. (A) Curva volume-tempo rappresentativa e corrispondente curva dV/dt. Quest’ultimo raffigura la velocità del flusso con un picco di riempimento precoce distinto (E’) e un picco di contrazione atriale (A’). (B) Curva GLS rappresentativa che indica la deformazione della deformazione in direzione longitudinale durante tutto il ciclo cardiaco. (C) Curva HDF rappresentativa con picchi di forza distinti nella direzione apice-base, a partire dalla forza di espulsione sistolica e seguita da una forza verso il basso alla transizione tra sistole e diastole, forza di decelerazione dell’onda E, accelerazione dell’onda A e forza di decelerazione. (D) Risultati descrittivi di tutti gli animali per i valori di EF, rapporto E’/A’, gls di picco e quadrato medio della radice dell’HDF in direzioni apice-base e inferolaterale-anteroseptale. I valori sono espressi come ± SD. Abbreviazioni: LV = ventricolo sinistro; V = volume; t = tempo; GLS = ceppo longitudinale globale; HDF = forze emodinamiche; EF = frazione di eiezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Video supplementare 1: Ricostruzione rappresentativa di immagini CINE retrospettivamente chiuse in viste SA, 2CH, 3CH e 4CH. Abbreviazioni: SA = asse corto; CH = camera. Clicca qui per scaricare questo video. Materiale supplementare: Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Il protocollo presentato descrive l’uso dell’imaging CMR per esperimenti longitudinali, non invasivi e in vivo per analizzare la funzione cardiaca nei topi. Questi risultati sono esempi di animali sani per dimostrare la fattibilità dell’utilizzo di immagini CINE per quantificare i parametri cardiaci. Tuttavia, i metodi descritti possono essere utilizzati per vari modelli animali. Sebbene specifici modelli di malattia possano richiedere piccole alterazioni del protocollo, la sua struttura di base per valutare i diversi parametri funzionali cardiaci sarà molto simile. Un caso particolare degno di nota è un modello di infarto miocardico in cui parte del cuore ha una significativa perdita di contrattilità. Ciò può causare una bassa qualità del segnale del navigatore cardiaco all’interno di questa fetta. In questo caso, un’opzione alternativa sarebbe l’acquisizione del navigatore da una fetta separata, come descritto in un precedente studio di Coolen et al.¹⁶. Le immagini CINE in diverse viste sono ricostruite da dati retrospettivamente gated utilizzando algoritmi CS e vengono analizzate utilizzando un software di analisi delle immagini per calcolare i valori di deformazione e HDF.

La qualità delle immagini acquisite dipende naturalmente da tutte le fasi di preparazione, che devono essere eseguite con attenzione prima di iniziare il protocollo MRI cardiaco. Ad esempio, se non si osservano chiari segnali ECG e respiratori quando si posiziona l’animale all’interno dello scanner MRI, ciò probabilmente comporterà acquisizioni non ottimali e persino un aumento dei tempi di scansione a causa dell’effetto aggiunto delle distorsioni magnetoidrodinamiche¹⁷. È importante rendersi conto che a causa della pianificazione sequenziale degli orientamenti delle fette, gli animali non possono essere semplicemente riposizionati tra le scansioni. Non è quindi possibile regolare nuovamente i cavi ECG tra una scansione e l’altra, in quanto ciò altererà la posizione del mouse nello scanner. Durante la scansione, il controllo della temperatura è fondamentale per mantenere un intervallo cardiaco e respiratorio costante, che avvantaggia in particolare la qualità delle scansioni retrospettivamente chiuse che vengono acquisite per un periodo di tempo più lungo. Durante questa scansione ad alto ciclo di lavoro, la temperatura dell’animale potrebbe aumentare costantemente, causando l’aumento della frequenza cardiaca e respiratoria. La regolazione della temperatura dell’impianto di riscaldamento e dell’anestesia potrebbe contribuire notevolmente a stabilizzare la frequenza respiratoria prima o durante la scansione.

Un passaggio critico durante l’analisi è la coerenza nel disegno del contorno. Mentre la segmentazione automatica funziona bene per i dati clinici, non funziona in modo robusto nel caso di dati cardiaci di topo (non testati per i ratti). L’alta frequenza cardiaca e l’elevato flusso sanguigno durante specifiche fasi cardiache, specialmente all’inizio del riempimento di LV, possono causare dephasing intravoxel e vuoti di segnale, compromettendo la delineazione della parete miocardica. Non è quindi consigliabile analizzare ogni fotogramma in modo indipendente, ma ispezionare visivamente il movimento della parete miocardica tra i fotogrammi e tenerne conto quando si disegnano i contorni su tutti i fotogrammi. Si consiglia di copiare e regolare il contorno endocardico tra due fotogrammi consecutivi per mantenere un movimento contrattile più naturale nell’analisi. In questo protocollo, i muscoli papillari sono esclusi dal volume del lume ventricolare nelle immagini SA per la valutazione della funzione sistolica e diastolica, mentre sono inclusi nelle viste 2CH, 3CH e 4CH per l’analisi del ceppo e dell’HDF perché quest’ultima si basa sulla conoscenza del movimento preciso della parete miocardica, piuttosto che sul volume preciso del lume ventricolare.

Mentre i parametri di funzione sistolica e diastolica si basano sulla misurazione dei volumi di LV durante tutto il ciclo cardiaco, i parametri di deformazione e HDF dipendono anche dai modelli di movimento all’interno della parete miocardica. Per questo, vengono utilizzate tecniche di tracciamento delle caratteristiche in cui lo spostamento del segmento miocardico può essere valutato riconoscendo caratteristiche anatomiche distinte e intensità del segnale tra le fasi CINE successive. Il forte contrasto tra pool sanguigno e miocardio nelle immagini CMR facilita l’uso del feature-tracking per il successivo ceppo e l’analisi HDF⁸. Prima del tracciamento delle caratteristiche CMR, il ceppo miocardico è stato determinato con ecografia di tracciamento delle macchie e marcatura dei tessuti CMR. Il tracciamento delle funzionalità CMR non richiede tempo di scansione aggiuntivo rispetto all’etichettatura dei tessuti CMR. Tuttavia, nonostante l’uso dell’innesco retrospettivo, la CMR ha ancora una risoluzione temporale limitata, che potrebbe rendere difficile valutare correttamente le deformazioni veloci all’interno del ciclo cardiaco.

La valutazione dell’HDF durante tutto il ciclo cardiaco richiede misurazioni dei diametri delle valvole mitrale e aortica per calcolare l’HDF in direzioni apice-base e inferolaterale-anteroroseptale utilizzando le equazioni precedentemente descritte¹⁸. Questo metodo ha mostrato stime coerenti dell’HDF rispetto allo standard di riferimento 4D-flow MRI, che ha una disponibilità limitata nell’uso clinico a causa della sua complessità⁶. È importante sapere che una stima robusta dei diametri delle valvole è difficile e, pertanto, i diametri delle valvole dovrebbero essere mantenuti costanti per un gruppo di animali e attraverso misurazioni ripetute in uno studio longitudinale, poiché le variazioni di questo parametro da stime errate potrebbero facilmente oscurare sottili cambiamenti nei parametri HDF. Il software specifico utilizzato per calcolare i parametri GLS e HDF potrebbe non essere disponibile per tutti gli utenti. Pertanto, si può fare riferimento a Voigt et al.¹⁹ (GLS) e Pedrizzetti et al.^6,20 (HDF), che contengono tutte le descrizioni matematiche che costituiscono la base dei rispettivi calcoli eseguiti dal software di analisi.

Ai fini di questo studio, il protocollo è stato valutato in animali sani (N = 6). Un insieme rappresentativo di curve temporali per volume LV, dV/dt, endoGLS e HDF è mostrato nella Figura 5A–C. I valori medi di più parametri funzionali cardiaci (EF, rapporto E’/A’, picco GLS e HDF) sono mostrati nella Figura 5D. Questi concordano bene con protocolli comparabili usati in letteratura²¹. La letteratura sui dati GLS e HDF nei topi è scarsa. È stato misurato un valore GLS medio del -22,8%, che è nello stesso intervallo del dato clinico⁸, indicando che le misurazioni GLS ottenute con il metodo descritto sono fattibili nei topi. Le curve HDF ottenute nei topi mostrano anche le stesse fasi distinte osservate nei dati umani, mostrando la traduzione di successo di questa tecnica nella ricerca preclinica. Mentre i parametri HDF sono ipotizzati per servire come biomarcatori precoci della disfunzione cardiaca, sono necessari ulteriori studi per indagare il valore diagnostico e predittivo di questo nuovo parametro. I risultati di questo protocollo mostrano che i risultati di HDF e GLS dovrebbero essere più variabili tra gli animali, il che deve essere preso in considerazione quando sono previste sottili differenze nei modelli animali o negli effetti del trattamento.

Materials

Equipment
AccuSens single and multi-channel signal conditioner	Opsens solutions inc., Canada	ACS-P4-N-62SC	Used with fiber optic temperature sensor to monitor body temperature
Duratears eye ointment	Alcon Nederland B.V., Netherlands
Mouse cell	Équipment Vétérinaire Minerve, France		referred to as mouse cradle
MR-compatible Monitoring & Gating System for Small animals	SA Intuments, Inc., United States	Model 1030	ERT Module (ECG/respiratory interface module) , ERT Control/Gating Module, battery pack and subdermal ECG Electrode Set
MRI scanner	MR Solutions Ltd., United Kingdom	Model: MRS-7024	Preclinical MRI System 7.0T/24 cm
Multistation temperature control unit and High Flow PCA	Équipment Vétérinaire Minerve, France	Model: URT Multipostes	animal heating system
Respiration Sensor	Graseby Medical Limited, United Kingdom	Ref 2005100
RF coil	MR Solutions Ltd., United Kingdom	MRS-MVC	38mm mouse volume RF coil for mouse body studies
SF flowmeter	flow-meter, Italy	SF 3
Vaporizer sigma delta Intermed	Penlon Ltd., United Kingdom
Materials
Isoflurane	AST farma, Netherlands
Vaseline petroleum jelly	Unilever, United Kingdom
Software
BART toolbox			https://mrirecon.github.io/bart/
Mathematica 12.0	Wolfram Research, Inc., United States
MATLAB 2019a	The MathWorks,Inc., United States
MEDIS Suite MR	Medis Medical Imaging Systems B.V. ,Netherlands		Image analysis software
PC-SAM	SA Intuments, Inc., United States
Preclinical Scan	MR Solutions Ltd., United Kingdom		Scanning software
Retrospective version 7.0	Amsterdam UMC, the Netherlands		Reconstuction software: https://github.com/Moby1971?tab=repositories