Proteiner og aminholdige ligander kan kovalent knyttes til polysakkarider aktivert av cyanyleringsreagenset, 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate (CDAP), for å danne kovalent protein (ligand)-polysakkaridkonjugater. Denne artikkelen beskriver en forbedret protokoll for å utføre kontrollert CDAP-aktivering ved 0 °C og varierende pH og utføre etterfølgende konjugering av de aktiverte polysakkaridene.
Konjugatvaksiner er bemerkelsesverdige fremskritt innen vaksinering. For fremstilling av polysakkaridkonjugatvaksiner kan polysakkaridene enkelt funksjonaliseres og knyttes til vaksinebærerproteiner ved hjelp av 1-cyano-4-dimetylaminopyridintetrafluoroborate (CDAP), et cyanylerende reagens som er lett å håndtere. CDAP aktiverer polysakkarider ved å reagere med karbohydrathydroksylgrupper ved pH 7-9. Stabiliteten og reaktiviteten til CDAP er svært pH-avhengig. pH-en til reaksjonen reduseres også under aktivering på grunn av hydrolysen til CDAP, noe som gjør at god pH kontrollerer nøkkelen til reproduserbar aktivering. Den opprinnelige CDAP-aktiveringsprotokollen ble utført ved romtemperatur i ubuffered pH 9-løsninger.
På grunn av den raske reaksjonen under denne tilstanden (<3 min) og det medfølgende raske pH-fallet fra den raske CDAP-hydrolysen, var det utfordrende å raskt justere og opprettholde målreaksjonen pH på kort tid. Den forbedrede protokollen som er beskrevet her, utføres ved 0 °C, noe som bremser CDAP-hydrolysen og forlenger aktiveringstiden fra 3 min til ~15 min. Dimetylaminopyridin (DMAP) ble også brukt som en buffer for å forhåndsjustere polysakkaridløsningen til målaktiverings-pH før du legger til CDAP-reagenset. Den lengre reaksjonstiden, kombinert med den langsommere CDAP-hydrolysen og bruken av DMAP-buffer, gjør det enklere å opprettholde aktiverings-pH for hele aktiveringsprosessens varighet. Den forbedrede protokollen gjør aktiveringsprosessen mindre frenetisk, mer reproduserbar og mer egnet til å skalere opp.
Konjugatvaksiner, som de som består av polysakkarider som er kovalent knyttet til et bærerprotein, er blant de bemerkelsesverdige fremskrittene innen vaccinologi1,2. Polysakkarider, som T-celleuavhengige antigener, er dårlig immunogene hos spedbarn og induserer ikke minne, klasseveksling eller affinitetsmodning av antistoffer3. Disse manglene overvinnes i polysakkaridkonjugatvaksiner4. Siden de fleste polysakkarider ikke har et praktisk kjemisk håndtak for konjugering, må de først gjøres reaktive eller “aktiverte”. Det aktiverte polysakkaridet kobles deretter enten direkte til proteinet (eller modifisert protein) eller er funksjonalisert for ytterligere avledning før konjugering4. De fleste lisensierte polysakkaridkonjugatvaksiner bruker enten reduktiv aminering eller cyanylering for å aktivere polysakkaridhydroksyler. Cyanogenbromid (CNBr), et reagens som tidligere hadde blitt brukt til å aktivere kromatografi harpikser, ble opprinnelig brukt til polysakkaridavledning. CNBr krever imidlertid høy pH, vanligvis ~ pH 10,5 eller høyere, for delvis å deprotonere polysakkaridhydroksyler slik at de er tilstrekkelig nukleofile til å angripe cyanogruppen. Den høye pH kan være skadelig for base-labile polysakkarider, og verken CNBr eller den aktive cyano-esteren som opprinnelig ble dannet, er tilstrekkelig stabil ved så høy pH.
CDAP (1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate; Figur 1) ble introdusert av Lees et al. for bruk som et cyanylerende middel for aktivering av polysakkarider5,6. CDAP, som er krystallinsk og lett å håndtere, ble funnet å aktivere polysakkarider ved en lavere pH enn CNBr og med færre sidereaksjoner. I motsetning til CNBr kan CDAP-aktiverte polysakkarider direkte konjugeres til proteiner, noe som forenkler synteseprosessen. CDAP-aktiverte polysakkarider kan funksjonaliseres med diamin (f.eks. heksandiamin) eller en dihydrazid (f.eks. adipic dihydrazid, ADH) for å lage amino- eller hydrazid-derivatiserte polysakkarider. En høy konsentrasjon av homobifunctional reagens brukes til å undertrykke krysskobling av polysakkarider. Aminopolysakkarider kan deretter konjugereres ved hjelp av noen av de utallige teknikkene som brukes til proteinkonjugering. Hydrazid-derivatiserte polysakkarider kobles ofte til proteiner ved hjelp av karbodiimidreagens (f.eks. 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC))7. Ytterligere optimalisering av CDAP polysakkaridaktivering er beskrevet av Lees et al.8 og er innlemmet i protokollen som er beskrevet her.
Oversikt over CDAP-konjugering
CDAP-protokollen kan konseptualiseres som to faser: (1) aktiveringen av polysakkaridet og (2) konjugering av det aktiverte polysakkaridet med et protein eller en ligand (figur 2). Målet med det første trinnet er å effektivt aktivere polysakkaridet, mens målet med det andre er å effektivt konjugere til det aktiverte polysakkaridet. Det aktiverte polysakkaridet binder de to trinnene sammen. Denne konseptualiseringen bidrar til å fokusere på de kritiske elementene i hvert trinn. Figur 2 utvider denne konseptualiseringen, og viser ønskede aktiverings- og koblingsreaksjoner, sammen med hydrolysereaksjonene og sidereaksjonene.
I aktiveringsfasen er de tre største bekymringene CDAP-stabilitet, CDAP-reaksjon med polysakkaridhydroksylene og stabiliteten til det aktiverte polysakkaridet (figur 3). CDAP-hydrolyse øker med pH, det samme gjør hydrolysen til det aktiverte polysakkaridet og sidereaksjonene. CDAP-reaksjonen med polysakkaridet forenkles imidlertid ved å øke pH. Effektiv aktivering av polysakkarider med CDAP krever en balanse mellom 1) reaktivitet av polysakkarid og CDAP og 2) hydrolyse- og sidereaksjonene til både reagenset og det aktiverte polysakkaridet.
I den opprinnelige CDAP-aktiveringsprotokollen beskrevet av Lees et al.5ble CDAP-aktivering av polysakkarider utført ved romtemperatur i ubufferet pH 9-løsning. Aktiveringshastigheten ble funnet å være rask under denne tilstanden, og aktiveringen ville være fullført innen 3 minutter. Reaksjonen ble også ledsaget av rask hydrolyse av CDAP, noe som førte til en rask pH-dråpe av den ubufferede reaksjonsløsningen. Det var utfordrende å raskt heve og opprettholde reaksjonen pH på målverdien på så kort tid. I den beskrevne protokollen ble aktivering utført ved å legge til CDAP fra en 100 mg /ml lagerløsning til den ubuffered polysakkaridløsningen. PH ble hevet 30 s senere med “et likt volum på 0,2 M trietylamin”. Protein som skal konjugereres ble deretter tilsatt etter 2,5 min til aktiveringsreaksjonen. Spesielt var pH for aktiveringstrinnet ikke godt kontrollert og sannsynligvis i utgangspunktet overskredet målet pH. Den raske reaksjonen som krever rask pH-justering gjorde aktiveringsprosessen vanskelig å kontrollere og utfordrende å skalere opp.
I motsetning til den opprinnelige protokollen har den modifiserte protokollen som er beskrevet her to store forbedringer. For det første er pH i polysakkaridløsningen forhåndsjustert til målaktivering pH, ved hjelp av DMAP som buffer, før tillegg av CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 og har dermed god bufferkraft rundt pH 9, og i motsetning til mange andre buffere ble det ikke funnet DMAP for å fremme CDAP hydrolyse8. Videre er DMAP allerede en prosess mellomliggende og legger derfor ikke til en ny komponent til reaksjonsblandingen. Forhåndsjustering av pH før du legger til CDAP eliminerer den store pH-svingen i begynnelsen av reaksjonen og gir mer effektivt vedlikehold av mål-pH under reaksjonen. Den andre forbedringen er å utføre aktiveringsreaksjonen ved 0 °C, der frekvensen av CDAP-hydrolyse er markert langsommere enn ved romtemperatur. Med lengre halveringstid for reagens ved 0 °C økes aktiveringstiden fra 3 min til 15 minutter for å kompensere for den langsommere aktiveringshastigheten ved lavere temperatur. Den lengre reaksjonstiden gjør det i sin tur lettere å opprettholde reaksjonen pH. Bruken av 0 °C reduserer også nedbrytningen av pH-sensitive polysakkarider, noe som gjør det mulig å forberede konjugater av denne typen polysakkarid. Forbedringene i protokollen gjør aktiveringsprosessen mindre frenetisk, enklere å kontrollere, mer reproduserbar og mer mottagelig for oppskalering.
Denne artikkelen beskriver den forbedrede protokollen for å utføre kontrollert CDAP-aktivering av polysakkarid ved 0 °C og ved et angitt mål-pH og utføre etterfølgende avledning av de aktiverte polysakkaridene med ADH. Også beskrevet er en trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) analyse, basert på metoden til Qi et al.9, for bestemmelse av hydrazidnivå på det modifiserte polysakkaridet. En modifisert analyse for heksoser basert på resorcinol og svovelsyre10 er også beskrevet, som kan brukes til å bestemme et bredere spekter av polysakkarider. Hvis du vil ha mer informasjon om CDAP-aktivering og -konjugering, refereres leseren til tidligere publikasjoner5,6,8 av Lees et al.
CDAP er et praktisk reagens for å avlede og konjugere polysakkarider. Denne artikkelen beskriver den generelle metoden for å bruke CDAP til å avlede polysakkarider med hydrazides (PS-ADH) og inneholder nylig publiserteforbedringer 8. For det første understreker teknikken viktigheten av å opprettholde mål-pH for å kontrollere aktiveringsprosessen. Vi fant ut at selv om mange vanlige buffere forstyrrer CDAP-aktiveringsreaksjonen, kan DMAP brukes som buffer for å administrere pH8. Videre er DMAP allerede et reaksjonsbiprodukt av CDAP-aktivering. Til slutt, bufring av polysakkaridløsningen med DMAP før du legger til CDAP, letter presis målretting og vedlikehold av reaksjonen pH. Som vi beskriver, er det nyttig å justere pH for den konsentrerte DMAP-lagerløsningen slik at den når den fortynnes når den målrettede pH. For det andre bremset prosessen i kulde reaksjonstiden, noe som gjorde aktiveringsprosessen mindre frenetisk og mer tilgivende. Lavere temperatur reduserte hastigheten på CDAP hydrolyse, og den optimale aktiveringstiden ved pH 9 øker fra ~ 3 min til ~ 15 min. I tillegg er det nødvendig med mindre CDAP for å oppnå samme aktiveringsnivå enn ved romtemperatur.
ADH-derivatiserte polysakkarider kan konjugeres til proteiner ved hjelp av karbodiimider (f.eks. EDAC)7. For eksempel bruker flere lisensierte Haemophilus influensa b (Hib) vaksiner polyribosylribitolphosphate (PRP) derivatisert med ADH for å konjugere til stivkrampetoksoid ved hjelp av EDAC. CNBr ble opprinnelig ansatt, men CDAP er et mye enklere reagens å bruke til dette formålet. Etter vår erfaring er et godt målområde for ADH-avledning 10-30 hydrazides per 100 kDa polysakkarid eller ~ 1-3% ADH etter vekt.
Den samme prosessen kan brukes til å avlede polysakkarider med primære aminer ved å erstatte ADH for en diamin. Det anbefales å bruke heksandiamin for å avlede polysakkarider med aminer8. Det aminerte polysakkaridet (PS-NH2) kan konjugeres ved hjelp av reagenser utviklet for proteinkonjugering11. PS-NH2 avledes vanligvis med en maleimid (f.eks. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-karboksylat (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oksuccinimid ester (GMBS)), og proteinet er tiolated (f.eks. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimid kjemi er svært effektiv.
Proteiner kan også kobles direkte til CDAP-aktiverte polysakkarider via ɛ-amin på lysiner. Mens aktiveringsprotokollen som brukes, generelt ligner den som er beskrevet her, er det nødvendig å optimalisere aktiveringsnivået, polysakkaridet og proteinkonsentrasjonen, samt protein: polysakkaridforholdet5,6,8.
Dextran er en av de enkleste polysakkaridene å aktivere med CDAP på grunn av sin relativt høye tetthet av hydroksylgrupper, men noen polysakkarider, som Vi antigen, kan være utfordrende. Følgelig er det ingen enkelt “beste” protokoll for CDAP-konjugering direkte til proteiner. Vi foreslår først å utvikle en protokoll for å oppnå passende aktiveringsnivåer, som bestemt av omfanget av hydrazidavledning, og deretter fortsette å lede proteinkonjugering til CDAP-aktivert polysakkarid.
The authors have nothing to disclose.
Verket som er beskrevet her ble finansiert av Fina Biosolutions LLC.
Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
Analytical balance | |||
Autotitrator or electronic pipet | |||
Beaker 2-4 L | |||
CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
Flake ice | |||
HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
NaCl | VWR | BDH9286 | |
NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
pH meter | |||
pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
pH temperature probe | |||
Pipets & tips | |||
Saline or PBS | |||
Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
Small ice bucket | |||
Small spatula | |||
Stir plate | |||
Resorcinol assay | |||
Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
DI water | |||
Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
Heating block | |||
Nitrile gloves | VWR | ||
Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
Resorcinol | Sigma | 398047 | |
Sugar standard | As appropriate | ||
Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
Timer | |||
TNBS assay | |||
Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |