Proteiner och aminer som innehåller ligander kan kovalent kopplas till polysackarider som aktiveras av cyanylationsreagenset, 1-cyano-4-dimethylaminopyridintetrafluorborat (CDAP), för att bilda kovalentprotein (ligand)-polysackaridkonjugater. Denna artikel beskriver ett förbättrat protokoll för att utföra kontrollerad CDAP aktivering vid 0 °C och varierande pH och utföra efterföljande konjugation av aktiverade polysackarider.
Konjugatvacciner är anmärkningsvärda framsteg inom vaccinologi. För beredning av polysackaridkonjugatvacciner kan polysackariderna bekvämt funktionaliseras och kopplas till vaccinbärarproteiner med 1-cyano-4-dimethylaminopyridintefluoreborat (CDAP), ett lätt hantera cyanylerande reagens. CDAP aktiverar polysackarider genom att reagera med kolhydrathydroxidgrupper vid pH 7-9. Cdap:s stabilitet och reaktivitet är mycket pH-beroende. Reaktionens pH minskar också under aktiveringen på grund av hydrolysen av CDAP, vilket gör bra pH-kontroll nyckeln till reproducerbar aktivering. Det ursprungliga CDAP-aktiveringsprotokollet utfördes vid rumstemperatur i obyggda pH 9-lösningar.
På grund av den snabba reaktionen under detta tillstånd (<3 min) och den medföljande snabba pH-droppen från den snabba CDAP-hydrolysen var det utmanande att snabbt justera och bibehålla målreaktions-pH under den korta tidsramen. Det förbättrade protokollet som beskrivs här utförs vid 0 °C, vilket saktar cdap hydrolys och förlänger aktiveringstiden från 3 min till ~15 min. Dimetyllaminopyridin (DMAP) användes också som buffert för att förjustera polysackaridlösningen till målaktiverings-pH innan CDAP-reagenset tillskom. Den längre reaktionstiden, i kombination med den långsammare CDAP-hydrolysen och användningen av DMAP-buffert, gör det lättare att upprätthålla aktiverings-PH under hela aktiveringsprocessen. Det förbättrade protokollet gör aktiveringsprocessen mindre frenetisk, mer reproducerbar och mer mottaglig för skalning.
Konjugatvacciner, såsom de som består av polysackarider som är kovalely kopplade till ett bärarprotein, är bland de anmärkningsvärda framstegen inom vaccinologi1,2. Polysackarider, som T-cellsoberoende antigener, är dåligt immunogena hos spädbarn och inducerar inte minne, klassväxling eller affinitetsmognad av antikroppar3. Dessa brister övervinns i polysackaridkonjugatvacciner4. Eftersom de flesta polysackarider inte har ett bekvämt kemiskt handtag för konjugation måste de först göras reaktiva eller “aktiveras”. Den aktiverade polysackariden är sedan kopplad antingen direkt till proteinet (eller modifierat protein) eller är funktionell för ytterligare derivatisering före konjugation4. De flesta licensierade polysackaridkonjugatvacciner använder antingen reduktiv amination eller cyanylering för att aktivera polysackaridhydroxiler. Cyanogenbromid (CNBr), ett reagens som tidigare hade använts för att aktivera kromatografi hartser, användes ursprungligen för polysackaridderivatisering. CNBr kräver dock högt pH, vanligtvis ~ pH 10,5 eller mer, för att delvis avprotonera polysackaridhydroxiler så att de är tillräckligt nukleofila för att attackera cyanogruppen. Det höga pH-talet kan vara skadligt för baslabbila polysackarider, och varken CNBr eller den aktiva cyano-ester som ursprungligen bildades är tillräckligt stabil vid så högt pH.
CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborate; Figur 1) introducerades av Lees et al. för användning som cyanylerande medel för aktivering av polysackarider5,6. CDAP, som är kristallint och lätt att hantera, visade sig aktivera polysackarider vid ett lägre pH än CNBr och med färre sidoreaktioner. Till skillnad från CNBr kan CDAP-aktiverade polysackarider konjugeras direkt till proteiner, vilket förenklar syntesprocessen. CDAP-aktiverade polysackarider kan funktionaliseras med en diamin (t.ex. hexandiamin) eller en dihydrazid (t.ex. adipic dihydrazide, ADH) för att göra amino- eller hydrazide-derivatiserade polysackarider. En hög koncentration av homobifunktionellt reagens används för att undertrycka korslänkning av polysackarider. Aminopolysackarider kan sedan konjugeras med någon av de otaliga tekniker som används för proteinkonjugation. Hydrazide-derivatized polysackarider är ofta kopplade till proteiner med hjälp av en karbodiimide reagens (t.ex. 1-etyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimide (EDAC))7. Ytterligare optimering av CDAP polysackarid aktivering har beskrivits av Lees et al.8 och ingår i protokollet beskrivs här.
Översikt över CDAP-konjugation
CDAP-protokollet kan konceptualiseras som två faser: (1) aktivering av polysackarid och (2) konjugation av den aktiverade polysackariden med ett protein eller ligand (Figur 2). Målet med det första steget är att effektivt aktivera polysackariden, medan målet med det andra är att effektivt konjugera till den aktiverade polysackariden. Den aktiverade polysackariden binder ihop de två stegen. Denna konceptualisering hjälper till att fokusera på de kritiska elementen i varje steg. Figur 2 expanderar på denna konceptualisering, som visar önskade aktiverings- och kopplingsreaktioner, tillsammans med hydrolysreaktioner och sidoreaktioner.
Under aktiveringsfasen är de tre största problemen CDAP-stabilitet, CDAP-reaktion med polysackaridhydroxiler och stabiliteten hos den aktiverade polysackariden (figur 3). CDAP-hydrolysen ökar med pH, liksom hydrolysen av den aktiverade polysackariden och sidoreaktionerna. CDAP-reaktionen med polysackarid underlättas dock genom att öka pH-talet. Effektiv aktivering av polysackarider med CDAP kräver en balans mellan 1) polysackaridens reaktivitet och CDAP och 2) hydrolys- och sidoreaktionerna hos både reagenset och den aktiverade polysackariden.
I det ursprungliga CDAP aktivering protokollet beskrivs av Lees et al.5,CDAP aktivering av polysackarider utfördes vid rumstemperatur i obebyggd pH 9 lösning. Aktiveringshastigheten konstaterades vara snabb under detta tillstånd, och aktiveringen skulle vara klar inom 3 minuter. Reaktionen åtföljdes också av snabb hydrolys av CDAP, orsakar en snabb pH droppe av den obyggda reaktionslösningen. Det var utmanande att snabbt höja och behålla reaktions-pH vid målvärdet på så kort tid. I det beskrivna protokollet utfördes aktivering genom att cdap tillsatts från en 100 mg/ml stamlösning till den obebyggda polysackaridlösningen. PH höjdes 30 s senare med “en lika stor volym på 0,2 M trietylamin”. Protein som ska konjugeras tillsattes sedan efter 2,5 min till aktiveringsreaktionen. I synnerhet var pH för aktiveringssteget inte välkontrollerat och överskred sannolikt initialt mål-pH. Den snabba reaktionen som krävde snabb pH-justering gjorde aktiveringsprocessen svår att kontrollera och utmanande att skala upp.
I motsats till det ursprungliga protokollet har det ändrade protokollet som beskrivs här två stora förbättringar. För det första är pH-enheten för polysackaridlösningen förjusterad till målaktiverings-pH, med DMAP som buffert, före tillsats av CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 och har därmed god buffringseffekt runt pH 9, och till skillnad från många andra buffertar befanns DMAP inte främja CDAP-hydrolys8. Dessutom är DMAP redan en process mellanliggande och lägger därför inte till en ny komponent i reaktionsblandningen. Förjustering av pH-värde innan CDAP tillsätts eliminerar den stora pH-gungan i början av reaktionen och möjliggör ett effektivare underhåll av mål-pH under reaktionen. Den andra förbättringen är att utföra aktiveringsreaktionen vid 0 °C, där frekvensen av CDAP-hydrolys är markant långsammare än vid rumstemperatur. Med den längre reagenshalvtiden vid 0 °C ökas aktiveringstiden från 3 min till 15 min för att kompensera för den långsammare aktiveringshastigheten vid lägre temperatur. Den längre reaktionstiden gör det i sin tur lättare att bibehålla reaktions-pH. Användningen av 0 °C saktar också nedbrytningen av pH-känsliga polysackarider, vilket gör det möjligt att förbereda konjugat av denna typ av polysackarid. Förbättringarna i protokollet gör aktiveringsprocessen mindre frenetisk, lättare att kontrollera, mer reproducerbar och mer mottaglig för skalning.
Denna artikel beskriver det förbättrade protokollet för att utföra kontrollerad CDAP-aktivering av polysackarid vid 0 °C och vid ett angivet mål pH och utföra efterföljande derivatisering av aktiverade polysackarider med ADH. Också beskrivet är en trinitrobensulfonsyra (TNBS) analys, baserad på metoden Qi et al.9, för bestämning av hydrazid nivå på den modifierade polysackarid. En modifierad analys för hexoser baserad på resorcinol och svavelsyra10 beskrivs också, som kan användas för att bestämma ett bredare spektrum av polysackarider. För mer information om AKTIVERING och konjugation av CDAP hänvisas läsaren till tidigare publikationer5,6,8 av Lees et al.
CDAP är ett bekvämt reagens för att derivatera och konjugera polysackarider. I den här artikeln beskrivs den allmänna metoden för att använda CDAP för att härleda polysackarider med hydrazider (PS-ADH) och innehåller nyligen publicerade förbättringar8. För det första betonar tekniken vikten av att upprätthålla mål pH för att styra aktiveringsprocessen. Vi fann att även om många vanliga buffertar stör CDAP-aktiveringsreaktionen, kan DMAP framgångsrikt användas som buffert för att hantera pH8. Dessutom är DMAP redan en reaktionsbiprodukt av CDAP-aktivering. Slutligen underlättar buffring av polysackaridlösningen med DMAP innan CDAP tillsätts exakt inriktning och underhåll av reaktions-pH. Som vi beskriver är det användbart att justera pH-et för den koncentrerade DMAP-stamlösningen så att den vid utspädning når det riktade pH-skat. För det andra saktade utförandet av processen i kylan reaktionstiden, vilket gjorde aktiveringsprocessen mindre frenetisk och mer förlåtande. Lägre temperatur minskade frekvensen av CDAP-hydrolys, och den optimala aktiveringstiden vid pH 9 ökar från ~ 3 min till ~ 15 min. Dessutom krävs mindre CDAP för att uppnå samma aktiveringsnivå som vid rumstemperatur.
ADH-derivatiserade polysackarider kan konjugeras till proteiner med hjälp av karbodiimider (t.ex. EDAC)7. Till exempel använder flera licensierade Haemophilus influenzae b (Hib) vacciner polyribosylribitolfosfat (PRP) derivatized med ADH för att konjugera till stelkramp toxoid med EDAC. CNBr var ursprungligen anställd, men CDAP är ett mycket lättare reagens att använda för detta ändamål. Enligt vår erfarenhet är ett bra målintervall för ADH-derivatisering 10-30 hydrazider per 100 kDa polysackarid eller ~ 1-3% ADH i vikt.
Samma process kan användas för att härleda polysackarider med primära aminer genom att ersätta ADH för en diamin. Det rekommenderas att använda hexandikamin för att derivatera polysackarider med aminer8. Den aminerade polysackariden (PS-NH2)kan konjugeras med reagenser utvecklade för proteinkonjugation11. Vanligtvis härleds PS-NH2 med en maleimid (t.ex. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimide ester (GMBS)), och proteinet är tämjt (t.ex. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimid kemi är mycket effektiv.
Proteiner kan också kopplas direkt till CDAP-aktiverade polysackarider via aminer på lysiner. Medan aktiveringsprotokollet som används i allmänhet liknar det som beskrivs här, är det nödvändigt att optimera aktiveringsnivån, polysackarid- och proteinkoncentrationen, liksom proteinet: polysackaridförhållandet5,6,8.
Dextran är en av de enklaste polysackariderna att aktivera med CDAP på grund av dess relativt höga densitet av hydroxylgrupper, men vissa polysackarider, såsom Vi-antigen, kan vara utmanande. Följaktligen finns det inget enda “bästa” protokoll för CDAP-konjugation direkt till proteiner. Vi föreslår först att utveckla ett protokoll för att uppnå lämpliga nivåer av aktivering, som bestäms av omfattningen av hydrazide derivatization, och sedan fortsätta att rikta protein konjugation till CDAP-aktiverade polysackarid.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet som beskrivs här finansierades av Fina Biosolutions LLC.
Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
Analytical balance | |||
Autotitrator or electronic pipet | |||
Beaker 2-4 L | |||
CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
Flake ice | |||
HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
NaCl | VWR | BDH9286 | |
NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
pH meter | |||
pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
pH temperature probe | |||
Pipets & tips | |||
Saline or PBS | |||
Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
Small ice bucket | |||
Small spatula | |||
Stir plate | |||
Resorcinol assay | |||
Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
DI water | |||
Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
Heating block | |||
Nitrile gloves | VWR | ||
Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
Resorcinol | Sigma | 398047 | |
Sugar standard | As appropriate | ||
Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
Timer | |||
TNBS assay | |||
Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |