半翅目肠道中植物病毒和昆虫载体蛋白的免疫荧光标记
Summary
这种用于切除昆虫肠道中植物病毒蛋白和载体昆虫蛋白的免疫荧光标记的协议可用于研究病毒和载体昆虫之间的相互作用、昆虫蛋白功能和病毒传播的分子机制。
Abstract
自然界中的大多数植物病毒都是通过半翅目昆虫从一种植物传播到另一种植物的。在病毒传播方面效率高的媒介昆虫的高种群密度在田间病毒流行中起着关键作用。研究病毒-昆虫媒介相互作用可以促进我们对病毒传播和流行病的理解，目的是设计控制植物病毒及其媒介昆虫的新策略。免疫荧光标记已被广泛用于分析病原体和宿主之间的相互作用，并用于白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera），它有效地传播南方水稻黑条纹侏儒病毒（SRBSDV，斐济病毒属，呼肠孤科），以定位中肠上皮细胞中的病毒粒子和昆虫蛋白。使用激光扫描共聚焦显微镜，我们研究了中肠上皮细胞的形态特征，昆虫蛋白的细胞定位以及病毒粒子和昆虫蛋白的共定位。该协议可用于研究昆虫中的病毒活动，昆虫蛋白质的功能以及病毒与媒介昆虫之间的相互作用。
Introduction
大多数描述的植物病毒是由半翅目昆虫传播的，包括蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱和蓟马1，2。半翅目昆虫的刺吸口器刺穿植物组织以进食和分泌唾液，同时有效地传播病毒2。已经描述了植物病毒通过媒介昆虫的不同传播机制。这些包括非持久性、半持久性和持久性。持久性类型要么是非繁殖型，要么是繁殖型3，4，但对于这两种类型，传播的病毒必须在昆虫的整个身体中移动。在持续繁殖模式下，病毒最初感染并在昆虫肠道的上皮细胞中复制，然后传播到不同的组织中，最终进入唾液腺，然后从那里它们可以在昆虫进食期间通过唾液引入植物5，6。持续传播的病毒通过不同的器官并在其昆虫载体中复制，这需要病毒和载体成分在不同阶段的特定相互作用7，8。
病毒蛋白和昆虫蛋白必须相互作用，以促进病毒识别、感染、复制或传播的关键过程在媒介昆虫中9，10。虽然光学显微镜可用于观察昆虫的细胞结构，但它不能显示病毒粒子分布，病毒蛋白和昆虫蛋白的细胞定位或共定位，或昆虫组织和细胞的超微结构。免疫荧光标记首先由Coons等人通过标记特定的荧光素抗体在小鼠的吞噬细胞中进行，现在被广泛使用11。免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是最早开发的免疫标记技术之一，是基于抗原与抗体之间的特异性结合反应11，12。已知抗体首先用荧光素标记，荧光素用作检测细胞或组织中相应抗原的探针13，14。荧光素标记的抗体与细胞或组织中的相应抗原结合后，探针在用激发波长照射并用荧光显微镜观察以定位抗原15时会发出明亮的荧光。
植物病毒的大多数媒介昆虫是半翅目。对植物病毒具有高传播效率的媒介昆虫种群密度较高，可导致病毒流行5。南方水稻黑纹矮病毒（SRBSDV，斐济病毒属，呼肠孤病毒科）是水稻最严重的病原菌之一，在东亚和东南亚的水稻种植区迅速蔓延，自2010年以来造成严重减产16，17。白背飞虱（WBPH，Sogatella furcifera Horváth）的成虫和若虫以持续繁殖的方式高效将SRBSDV传播给水稻。现场研究表明，SRBSDV诱发的水稻黑条纹侏儒病的暴发通常与WBPH的大规模长距离迁移同时发生，这是SRBSDV流行的关键因素7，8，18。囊泡相关膜蛋白7（VAMP7）是一种可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE），可通过囊泡融合介导物质的转运。VAMP7在体外与SRBSDV的外主要衣壳蛋白相互作用，这表明VAMP7可能与病毒传播密切相关16。
在这里介绍的方案中，我们从病毒性WBPH中切除肠道，作为标记中肠上皮细胞中SRBSDV病毒粒子和VAMP7的例子16。作为病毒的初始入侵部位，中肠上皮在病毒感染、复制和传播中起着至关重要的作用。首先，我们详细介绍了从若虫和WBPH成虫中切除肠道的步骤。其次，我们使用特定的荧光素标记抗体来标记肠道上皮细胞中的SRBSDV病毒粒子和VAMP7。然后，我们通过激光扫描共聚焦显微镜观察上皮细胞以及病毒粒子和VAMP7的细胞位置。结果表明，SRBSDV病毒粒子和VAMP7在中肠上皮细胞的细胞质中可共定位，提示VAMP7的特异性功能可能与中肠上皮细胞病毒粒子的传播有关。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了获得最佳结果，应考虑几个关键点。首先，病毒性昆虫在总种群中的高比例是必要的。虽然WBPH若虫和成虫对SRBSDV的最低AAP为5分17秒，但应允许昆虫以新鲜SRBSDV感染的水稻植物为食2天，以实现高达80%的采集效率。由于可以在80%的中肠18中检测到SRBSDV病毒粒子，因此我们在本协议中2 d AAP后2 d切除并标记了病毒性昆虫。其次，成虫和若虫的肠道与头部的唾液腺?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金（31630058 X.W.和31772134 W.L.）的资助。
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
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