Hemipteran Bağırsaklarda Bitki Virüsü ve Böcek Vektör Proteinlerinin İmmünofloresan Etiketlenmesi
Summary
Eksize edilmiş böcek bağırsaklarında hem bitki virüsü proteinlerinin hem de vektör böcek proteinlerinin immünofloresan etiketlenmesi için bu protokol, virüs ve vektör böcekleri, böcek protein fonksiyonları ve virüs bulaşmasının altında yatan moleküler mekanizmalar arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Doğadaki çoğu bitki virüsü, hemipteran böcekler tarafından bir bitkiden diğerine bulaşır. Virüs bulaşmasında oldukça etkili olan vektör böceklerinin yüksek popülasyon yoğunluğu, alanlardaki virüs salgınlarında önemli bir rol oynamaktadır. Virüs-böcek vektör etkileşimlerini incelemek, bitki virüslerini ve vektör böceklerini kontrol etmek için yeni stratejiler tasarlamak amacıyla virüs bulaşması ve salgınlar hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir. İmmünofloresan etiketleme, patojenler ve konakçılar arasındaki etkileşimleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve burada, midgut epitel hücrelerindeki viryonları ve böcek proteinlerini bulmak için güney pirinç siyah çizgili cüce virüsünü (SRBSDV, cins Fijivirus, aile Reoviridae) verimli bir şekilde ileten beyaz sırtlı planthopper’da (WBPH, Sogatella furcifera) kullanılmaktadır. Lazer taramalı konfokal mikroskopi kullanarak, midgut epitel hücrelerinin morfolojik özelliklerini, böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunu ve viryonların ve bir böcek proteininin kolokalizasyonunu inceledik. Bu protokol, böceklerdeki virüs aktivitelerini, böcek proteinlerinin işlevlerini ve virüs ile vektör böceği arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Tanımlanan bitki virüslerinin çoğu, yaprak bitleri, beyaz sinekler, yaprakçıklar, planthoppers vethrips 1,2’yi içeren Hemiptera düzeninden böcekler tarafından bulaşır. Hemipteryen böceklerin delici-emici ağız kısımları, tükürüğü beslemek ve salgılamak için bitki dokusunu deler, aynı zamanda virüsü verimli bir şekilde iletir2. Bitki virüslerinin vektör böcekleri tarafından farklı bulaşma mekanizmaları tanımlanmıştır. Bunlar arasında kalıcı olmayan, yarı kalıcı ve kalıcı bulunur. Kalıcı tip ya yayılmaz ya da çoğaltıcı 3,4’tür, ancak bu türlerin her ikisi için de bulaşan virüs böceğin vücudu boyunca hareket etmelidir. Kalıcı-yayılım modunda, virüsler başlangıçta böceğin bağırsağının epitel hücrelerinde enfekte olur ve çoğalır, daha sonra farklı dokulara ve sonunda tükürük bezlerine yayılır, buradan daha sonra böcek besleme sırasında tükürük yoluyla bir bitkiye sokulabilirler 5,6. Kalıcı olarak bulaşan virüsler farklı organlardan geçer ve böcek vektörlerinde çoğalırlar, bu da farklı aşamalarda virüs ve vektör bileşenleri arasında spesifik etkileşimler gerektirir 7,8.
Viral proteinler ve böcek proteinleri, vektör böceklerinde virüs tanıma, enfeksiyon, replikasyon veya yayılma için kritik süreçleri kolaylaştırmak için etkileşime girmelidir 9,10. Optik mikroskopi böceklerdeki hücresel yapıları gözlemlemek için kullanılabilse de, virion dağılımını, viral proteinlerin ve böcek proteinlerinin hücresel lokalizasyonunu veya kolokalizasyonunu veya böcek dokularının ve hücrelerinin ultrayapısını gösteremez. İmmünofloresan etiketleme ilk olarak Coons ve ark. tarafından farenin fagositik hücrelerinde spesifik floresein antikorlarının etiketlenmesi yoluyla gerçekleştirilmiştir ve şimdi yaygın olarak kullanılmaktadır11. Floresan antikor tekniği olarak da bilinen immünofloresan tekniği, geliştirilen en eski immünolojik etiketleme tekniklerinden biridir ve antijen ile antikor11,12 arasındaki spesifik bağlanma reaksiyonuna dayanır. Bilinen antikor ilk olarak, hücrelerde veya dokularda karşılık gelen antijenleri tespit etmek için bir prob olarak kullanılan floresein ile etiketlenir13,14. Floresein etiketli antikor, hücrelerdeki veya dokulardaki karşılık gelen antijene bağlandıktan sonra, prob, uyarma dalga boyları ile ışınlandığında ve antijen15’i lokalize etmek için bir floresan mikroskobu ile görüntülendiğinde parlak floresan yayar.
Bitki virüslerinin çoğu vektör böcekleri hemipteranlardır. Bitki virüsü için yüksek bulaşma verimliliğine sahip vektör böceklerinin daha yüksek popülasyon yoğunluğu, virüs salgınlarına yol açabilir5. Pirincin en ciddi patojenlerinden biri olan Güney pirinç siyah çizgili cüce virüsü (SRBSDV, Fijivirus cinsi, Reoviridae familyası), Doğu ve Güneydoğu Asya’da pirinç yetiştirme alanlarına hızla yayılmış ve 2010 yılından bu yana ciddi verim kayıplarına neden olmuştur16,17. Beyaz sırtlı planthopper’ın yetişkinleri ve nimfleri (WBPH, Sogatella furcifera Horváth), SRBSDV’yi pirince yüksek verimlilikle kalıcı-yayılıcı bir şekilde iletir. Saha çalışmaları, SRBSDV kaynaklı pirinç siyah çizgili cüce hastalığının salgınlarının genellikle SRBSDV salgınlarında çok önemli bir faktör olan WBPH’lerin kitlesel uzun mesafeli göçü ile çakıştığını göstermiştir 7,8,18. Vezikülle ilişkili membran proteini 7 (VAMP7), vezikül füzyonu yoluyla maddelerin taşınmasına aracılık edebilen çözünür bir N-etilmaleimide duyarlı faktör bağlanma proteini reseptörüdür (SNARE). VAMP7, SRBSDV’nin in vitro dış majör kapsid proteini ile etkileşime girer, bu da VAMP7’nin virüs iletimi ile yakından ilişkili olabileceğini gösterir16.
Burada sunulan protokolde, midgut epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarını ve VAMP7’yi etiketlemek için örnek olarak virülifer WBPH’den bağırsakları eksize ettik16. Virüsün ilk istila yeri olan midgut epiteli, virüs enfeksiyonu, replikasyonu ve bulaşmasında hayati rol oynar. İlk olarak, bağırsakları nimflerden ve WBPH’lerin yetişkinlerinden çıkarma adımlarını detaylandırdık. İkincisi, bağırsak epitel hücrelerinde SRBSDV viryonlarını ve VAMP7’yi etiketlemek için spesifik floresein etiketli antikorlar kullandık. Daha sonra epitel hücrelerini ve viryonların ve VAMP7’nin hücresel lokalizasyonunu lazer taramalı konfokal mikroskopla gözlemledik. Sonuçlar, SRBSDV viryonlarının ve VAMP7’nin midgut epitel hücrelerinin sitoplazmasında kolokalize olabileceğini gösterdi, bu da VAMP7’nin spesifik işlevinin viryonların midgut epitel hücrelerinden yayılmasıyla ilişkili olabileceğini düşündürdü.
Protocol
Representative Results
Discussion
En iyi sonuçlar için, birkaç önemli nokta dikkate alınmalıdır. İlk olarak, toplam popülasyon arasında yüksek oranda virülifer böcek gereklidir. WBPH perileri ve yetişkinler tarafından SRBSDV için minimum AAP 5 dakika17 olmasına rağmen, böceklerin% 80’e varan bir kazanım verimliliği elde etmek için 2 gün boyunca taze SRBSDV ile enfekte olmuş pirinç bitkileriyle beslenmelerine izin verilmelidir. SRBSDV viryonları, midgutların18’inin% 80’inde tespit …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’ndan (31630058 X.W.’ye ve 31772134 W.L.’ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
Riferimenti
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D., Nault, L. R., Rodriquez, J. G. . Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. , 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining’omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
