Immunofluorescerende mærkning af plantevirus og insektvektorproteiner i hemipteran tarme

Summary

Denne protokol til immunfluorescerende mærkning af både plantevirusproteiner og vektorinsektproteiner i udskårne insekttarme kan bruges til at studere interaktioner mellem virus- og vektorinsekter, insektproteinfunktioner og molekylære mekanismer, der ligger til grund for virusoverførsel.

Abstract

De fleste plantevirus i naturen overføres fra en plante til en anden af hemipteran insekter. En høj populationstæthed af vektorinsekterne, der er yderst effektive til virusoverførsel, spiller en central rolle i virusepidemier på marker. Undersøgelse af virus-insektvektorinteraktioner kan fremme vores forståelse af virusoverførsel og epidemier med det formål at designe nye strategier til bekæmpelse af plantevira og deres vektorinsekter. Immunofluorescensmærkning er blevet brugt i vid udstrækning til at analysere interaktioner mellem patogener og værter og bruges her i den hvidryggede planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt overfører den sydlige ris sorte stribede dværgvirus (SRBSDV, slægten Fijivirus, familie Reoviridae), for at lokalisere virioner og insektproteiner i midgutepitelcellerne. Ved hjælp af laserscanningskonfokalmikroskopi studerede vi de morfologiske egenskaber ved midgutepitelceller, cellulær lokalisering af insektproteiner og colokalisering af virioner og et insektprotein. Denne protokol kan bruges til at studere virusaktiviteter i insekter, funktioner af insektproteiner og interaktioner mellem virus og vektorinsekt.

Introduction

De mest beskrevne plantevira overføres af insekter fra rækkefølgen Hemiptera, der inkluderer bladlus, hvidfluer, løvhopper, plantehoppere og thrips ^1,2. De piercing-sugende munddele af hemipteran insekter gennemborer plantevævet til fodring og udskillelse af spyt, samtidig med at virussen overføres effektivt². Forskellige transmissionsmekanismer af plantevirus af vektorinsekter er blevet beskrevet. Disse omfatter ikke-vedvarende, semipersistente og vedvarende. Den persistente type er enten ikke-propagativ eller propagativ^3,4, men for begge disse typer skal den overførte virus bevæge sig gennem insektets krop. I den vedvarende formeringstilstand inficerer vira oprindeligt og replikerer i epitelcellerne i insektets tarm, spredes derefter i forskellige væv og til sidst ind i spytkirtlerne, hvorfra de derefter kan indføres i en plante gennem spyt under insektfodring ^5,6. Persistente overførte vira bevæger sig gennem forskellige organer og replikerer i deres insektvektorer, hvilket kræver specifikke interaktioner mellem virus- og vektorkomponenter på forskellige stadier ^7,8.

Virale proteiner og insektproteiner skal interagere for at lette kritiske processer til virusgenkendelse, infektion, replikation eller spredning i vektorinsekterne ^9,10. Selvom optisk mikroskopi kan bruges til at observere cellulære strukturer i insekter, kan den ikke vise virionfordeling, cellulær lokalisering eller colokalisering af virale proteiner og insektprotein eller ultrastrukturen af insektvæv og celler. Immunofluorescensmærkning blev først udført af Coons et al. i musens fagocytiske celler ved hjælp af mærkning af specifikke fluoresceinantistoffer, og nu bruges den bredt¹¹. Immunofluorescensteknikken, også kendt som fluorescensantistofteknikken, er en af de tidligste immunologiske mærkningsteknikker, der er udviklet og er baseret på den specifikke bindingsreaktion mellem antigenet og antistoffet^11,12. Det kendte antistof mærkes først med fluorescein, som bruges som sonde til at detektere de tilsvarende antigener i cellerne eller vævene^13,14. Efter at det fluoresceinmærkede antistof binder til det tilsvarende antigen i celler eller væv, udsender sonden lys fluorescens, når den bestråles med excitationsbølgelængder og ses med et fluorescensmikroskop for at lokalisere antigenet¹⁵.

De fleste vektorinsekter af plantevirus er hemipteraner. En højere populationstæthed af vektorinsekter, der har en høj transmissionseffektivitet for plantevirussen, kan føre til virusepidemier⁵. Sydlig ris sort stribet dværgvirus (SRBSDV, slægt Fijivirus, familie Reoviridae), en af de mest alvorlige patogener af ris, har hurtigt spredt sig over risdyrkningsområder i Øst- og Sydøstasien og forårsaget alvorlige udbyttetab siden 2010^16,17. Voksne og nymfer af den hvidryggede planthopper (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) overfører SRBSDV til ris på en vedvarende-formidlende måde med høj effektivitet. Feltundersøgelser har vist, at udbrud af SRBSDV-induceret ris sort stribet dværgsygdom normalt falder sammen med massemigration over lange afstande af WBPH’er, en afgørende faktor i SRBSDV-epidemier ^7,8,18. Vesikelassocieret membranprotein 7 (VAMP7) er en opløselig N-ethylmaleimidfølsom faktorbindingsproteinreceptor (SNARE), som kan formidle transport af stoffer via vesikelfusion. VAMP7 interagerer med det ydre store capsidprotein i SRBSDV in vitro, hvilket indikerer, at VAMP7 kan være tæt forbundet med virusoverførsel¹⁶.

I protokollen, der præsenteres her, udskar vi tarmen fra viruliferous WBPH som et eksempel til at mærke SRBSDV-virioner og VAMP7 i midgut-epitelceller¹⁶. Som det første invasionssted for virus spiller midgutepitelet afgørende roller i virusinfektion, replikation og transmission. Først detaljerede vi trinene til at punktafgifter tarmen fra nymfer og voksne af WBPH’er. For det andet brugte vi specifikke fluoresceinmærkede antistoffer til at mærke SRBSDV-virioner og VAMP7 i tarmepitelceller. Derefter observerede vi epitelceller og den cellulære placering af virionerne og VAMP7 via et laserscanningskonfokalmikroskop. Resultaterne viste, at SRBSDV-virioner og VAMP7 kunne colokalisere i cytoplasmaet i midgut-epitelcellerne, hvilket tyder på, at VAMP7’s specifikke funktion kan være relateret til spredning af virioner fra midgut-epitelceller.

Protocol

1. Nonviruliferous insektopdræt Saml WBPH’er fra rismarker og bagside med risplanter i 1 L glasbægre dækket med insektsikkert net i en inkubator ved 28 °C med 16 timers lys og 8 timers mørke. Fordi SRBSDV ikke overføres via æg, er nyklækkede nymfer ikke viruliferous. Med en børstepen børstes insekter forsigtigt fra bægerglasset, der opdrætter insekter, til et nyt bægerglas med friske risplanter hver uge, indtil WBPH-nymfer er klækket. Fortsæt med at opdrætte disse klækkede nonvirulife…

Representative Results

Figur 1 illustrerer alle trin i denne protokol: insektopdræt, virusopkøb, udskæring af tarmen, immunfluorescerende mærkning og fremstilling af diaset. Udskårne WBPH-tarme fra voksne blev fikseret i 4% (m/v) paraformaldehyd, permeabiliseret med 2% (v/v) Triton X-100 og derefter inkuberet med Dylight 633 phalloidin10,18. Den laserscanningskonfokale mikrograf i figur 2 viser…

Discussion

For de bedste resultater bør et par nøglepunkter overvejes. For det første er et højt forhold mellem viruliferous insekter blandt den samlede befolkning nødvendig. Selvom den mindste AAP for SRBSDV af WBPH-nymfer og voksne er 5 min¹⁷, skal insekterne have lov til at fodre på friske SRBSDV-inficerede risplanter i 2 d for at opnå en erhvervelseseffektivitet på op til 80%. Da SRBSDV-virionerne kan påvises i 80% af midguts¹⁸, udskårne og mærkede vi de viruliferous in…

Materials

3% Bull serum albumin (BSA)	Coolaber	SL1331	Dilute antibodies
Cover glass	Solarbio	YA0771-18*18mm	For slide making
Dissecting microscope	Beitja	XTL-7045B1	For insect dissection
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	Zeiss LSM880	Observe fluorescence signal
Microscope slides	Solarbio	ZBP-7105	For slide making
Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Abcam	AB104139	Label cell necleus
Paraformaldehyde	Sigma	158127	For tissues fixation
Phalloidin	Invitrogen	A22284	Label actin of midgut epithiels
Triton X-100	Amresco	0290C484	For tissues permeation
Tweezers (5-SA)	AsOne	6-7905-40	For insect dissection