यह प्रोटोकॉल डीएनए निष्कर्षण से डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) के लिए प्रायोगिक सेट-अप तक के कदम प्रदान करता है, जिसमें GRNA-प्रेरित Cas9 दरार और डीएनए मरम्मत के बाद लक्षित स्थलों पर गैर-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (एनएचईजे) घटनाओं की पहचान और मात्राकरण के लिए विश्लेषण शामिल है । इस विधि के अन्य उपयोगों में बहुरूपता का पता लगाने और जीन-संपादन संस्करण सत्यापन जैसे अनुप्रयोग शामिल हैं।
मच्छर जीनोमिक्स और जेनेटिक इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों में हाल की प्रगति ने बड़े पैमाने पर लक्षित डीएनए अनुक्रम भिन्नता का पता लगाने के लिए त्वरित और कुशल तरीकों की आवश्यकता को बढ़ावा दिया है । विशेष रूप से, CRISPR गाइड आरएनए (gRNA) द्वारा उत्पन्न जीन-संपादित साइटों पर सम्मिलन और विलोपन (इनडेल) का पता लगाना/Cas9-मध्यस्थता गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने (एनएचईजे) म्यूटेनेसिस की निष्ठा और अनपेक्षित परिवर्तनों की आवृत्ति का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम यहां डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो उच्च-थ्रूपुट एनएचईजे विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। हालांकि यह विधि व्यक्तिगत अनुक्रम भिन्नता की पहचान करने वाले डेटा का उत्पादन नहीं करती है, यह जनसंख्या के भीतर अनुक्रम भिन्नता का मात्रात्मक अनुमान प्रदान करती है। इसके अतिरिक्त, उचित संसाधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को अगली पीढ़ी या सेंगर अनुक्रमण की तुलना में अधिक आसानी से स्थापित करने वाली फील्ड-साइट प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है। ddPCR में उन तरीकों में से किसी की तुलना में परिणामों के लिए तेजी से टर्न-अराउंड समय भी होता है, जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जीवों के क्षेत्र परीक्षणों के दौरान जंगली आबादी में आनुवंशिक भिन्नता के अधिक त्वरित और पूर्ण विश्लेषण की अनुमति देता है।
जीन ड्राइव में चिकित्सा और कृषि प्रासंगिकता की कीटों की आबादी को नियंत्रित करने की अपार संभावनाएं हैं1,2,3,4,5. उदाहरण के लिए, CRISPR कैस नाभिक और गाइड आरएनए (जीआरएएनए) पर आधारित जीन-ड्राइव प्रणालियों का उपयोग वेक्टर मच्छरों की आबादी को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है जो मलेरिया परजीवी को अपवर्तन प्रदान करते हैं जिससे संचरण कम होता है और कम रोग1,4, 5होताहै । जीन-ड्राइव प्रणाली पूर्व-मेयोटिक रोगाणु कोशिकाओं में एक समरूप गुणसूत्र से दूसरे के लिए खुद को और संबद्ध विशेषता की प्रतियां करती है, और यह सुनिश्चित करता है कि अधिकांश संतान ड्राइव के वारिस हैं और क्षेत्र में लंबे समय तक चलने वाली और टिकाऊ जनसंख्या संशोधन की क्षमता पैदा करते हैं। हालांकि, कैस/जीआरएनए-आधारित तरीकों का एक नुकसान गैर-समरूप अंत-जुड़ने (एनएचईजे) डीएनए मरम्मत के माध्यम से प्रविष्टि और विलोपन (इनडेल) म्यूटेशन पैदा करने की संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप ड्राइव प्रतिरोधी एलील्स की पीढ़ी होती है, जो जब जनसंख्या में उच्च पर्याप्त आवृत्ति तक जमा होती है, तो ड्राइव प्रणाली को1,2,3,4 से फैलने से रोक सकती है . यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट और विश्वसनीय विधि का विवरण देता है जो कैस/जीआरएनए-आधारित जीन ड्राइव के दौरान जनसंख्या और व्यक्तिगत दोनों स्तरों पर इनडेल म्यूटेशन की व्यापकता और सापेक्ष मात्रा निर्धारित कर सकता है ।
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियां अद्वितीय अनुक्रमण संकल्प प्रदान करती हैं। हालांकि, एनजीएस से जुड़ी लागत और तकनीकी आवश्यकताएं नियमित परीक्षण को प्रतिबंधित करतीहैं और6,7,8के अंत में उपयोग को उच्च-थ्रूपुट विधि के रूप में सीमित करती हैं। पारंपरिक पीसीआर क्वांटिफिकेशन विधियों का उपयोग लंबे समय से जीनोम इनडेल्स के लिए मानक मूल्यांकन प्रक्रिया के रूप में किया जाता रहा है; हालांकि, ये विधियां श्रम-प्रधान हैं, डेटा खरीदने के लिए एक लंबा समय लेते हैं, और उच्च स्तर की परिवर्तनशीलता होती है। डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर (डीडीपीसीआर) कुछ अनुप्रयोगों में सेंगर अनुक्रमण की तुलना में म्यूटेशन का पता लगाने में अधिक संवेदनशील साबित हुई है और अन्य6,7,8,9में एनजी की तुलना में कम पहचान सीमा है। इसके अलावा, परिणाम प्राप्त करने के लिए एक नमूना सेट और टर्न-अराउंड समय का आकलन करने की लागत क्रमशः कम खर्चीला और तेज है, डीडीपीसीआर के लिए या तो सेंगर अनुक्रमण या एनजीएस9की तुलना में । दोहरी जांच प्रणाली का उपयोग करते हुए, ड्रॉप-ऑफ परख GRNA निर्देशित लक्ष्य Cas9 कट साइट पर जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) अनुक्रम की अनुपस्थिति के आधार पर NHEJ alleles की पहचान करता है । इस परख में, कैस/gRNA आधारित प्रणाली की भविष्यवाणी की कटौती साइट सहित एक छोटी एम्प्लिकॉन एक विशिष्ट प्राइमर जोड़ी के साथ परिलक्षित होता है । एक फ्लोरोसेंट जांच एम्प्लिकॉन के एक संरक्षित क्षेत्र के लिए बाध्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया है और एक और फ्लोरोसेंट जांच कट साइट के डब्ल्यूटी अनुक्रम को पहचानता है । एनएचईजे एलील की उपस्थिति में, बाद में एम्प्लिकॉन से बांध नहीं होगा।
डीडीपीसीआर का उपयोग हटाने, एकल आधार-जोड़ी मतभेदों और सम्मिलन को लक्षित करने के लिए प्राइमर डिजाइन करने की क्षमता प्रदान करता है, जो मच्छर आबादी में एनएचईजे प्रोफाइलिंग के लिए अनुमतिदेगा 9का विश्लेषण करता है। इन आकर्षक विशेषताओं को देखते हुए, हमने मच्छरों में कैस/जीआरएनए आधारित जीन-ड्राइव प्रणाली से उत्पन्न इनल्ड का उच्च-थ्रूपुट डिटेक्शन के लिए डीडीपीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल बनाया ।
डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर कैस/जीआरएनए-आधारित जीन-ड्राइव प्रणाली में एनएचईजे घटनाओं के परिणामस्वरूप इनडेल एलील्स की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक कुशल तरीका है और व्यक्तियों या आबादी में इन एलील्स की आवृत्ति की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है । विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए विशेष सावधानी के साथ प्रोटोकॉल के कुछ चरणों का पालन करने की आवश्यकता है। सबसे पहले, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण को उच्च गुणवत्ता और पर्याप्त मात्रा सुनिश्चित करने के लिए सावधानीपूर्वक प्रदर्शन करने की आवश्यकता है। एक अच्छा निष्कर्षण प्रतिक्रिया प्रति हैप्लॉयड जीनोम प्रतियों के सटीक निर्धारण की अनुमति देगा। हमारे अनुभव में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) लगातार उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए निष्कर्षण प्रदान की है । हालांकि, व्यक्तिगत मच्छरों के अर्क विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हो सकते हैं क्योंकि डीएनए गोली कल्पना करना मुश्किल हो जाता है और सावधान नहीं होने पर आसानी से सुपरनैंट के साथ चूसा जा सकता है। दूसरे, प्राइमर और जांच को सावधानीपूर्वक डिजाइन किया जाना चाहिए । डीडीपीसीआर प्रयोग को पूरा करने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि डिज़ाइन किए गए प्राइमर पहले पारंपरिक पीसीआर का प्रदर्शन करके एक ही पीसीआर उत्पाद का परिणाम देते हैं और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के माध्यम से एक उत्पाद की कल्पना करते हैं। संदर्भ एफएएम जांच को भी डिजाइन किया जाना चाहिए ताकि यह एक उच्च संरक्षित अनुक्रम के पूरक हो। यह एक विविध आबादी में WT alleles का सटीक पता लगाने सुनिश्चित करेगा । प्रत्येक अनूठे प्रयोग के लिए प्राइमर/प्रोब संयोजनों में अलग-अलग थर्मोसाइकिलर की स्थिति होगी, और थर्मल ढाल का उपयोग करके उन स्थितियों को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है।
इनलों की पहचान करने के लिए अन्य तरीके मौजूद हैं, जैसे सेंगर अनुक्रमण या एनजीएस। सेंगर अनुक्रमण सीमित है क्योंकि इसमें उपन्यास वेरिएंट की पहचान करने के लिए पता लगाने और कम खोज शक्ति की सीमा कम है। सेंगर अनुक्रमण भी श्रम-प्रधान है और उच्च-थ्रूपुट नहीं है। सेंगर अनुक्रमण की तुलना में, एनजीस के पास कम संवेदनशीलता, खोज शक्ति और थ्रूपुट की समान सीमाएं नहीं हैं। एनजी का एक और लाभ एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNPs) से पुनर्व्यवस्थाओं के लिए विभिन्न प्रकार के उत्परिवर्तनों का पता लगाने की क्षमता है। हालांकि, NGS Cas9/gRNA से जुड़े indels का निर्धारण करने के आवेदन में एक अधिक महंगा और समय लेने वाली विधि है क्योंकि वहां ब्याज का केवल एक ही लक्ष्य क्षेत्र है, और यह सबसे बड़ा जीनोम व्यापक विश्लेषण के लिए अनुकूल है । उपर्युक्त तरीकों की तुलना में, डीडीपीसीआर उच्च थ्रूपुट है और इसमें त्वरित मोड़-चारों ओर समय है। यदि डीडीपीसीआर सामग्री और उपकरण घर में उपलब्ध हैं, तो 1-2 दिनों के भीतर 96 नमूनों को संसाधित किया जा सकता है, जिससे यह Cas9/gRNA-संशोधित जीवों के बड़े परीक्षणों के त्वरित विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हो जाता है।
जबकि डीडीपीसीआर के लिए कई लाभ मौजूद हैं, सीमाएं भी हैं। सबसे पहले, डीडीपीसीआर उपकरण एक स्वतंत्र प्रयोगशाला वातावरण में अक्सर उपलब्ध नहीं है। डीडीपीसीआर उपकरण बड़े अनुसंधान संस्थानों में सांप्रदायिक रूप से उपलब्ध हो सकते हैं, लेकिन यह संस्थान के बाहर डेटा उत्पादन और विश्लेषण में आसानी के लिए अनुमति नहीं देता है। दूसरे, विकल्पों के विपरीत, डीडीपीसीआर पहचाने गए इनडेल म्यूटेशन के व्यक्तिगत अद्वितीय दृश्य प्रदान नहीं करता है। डिजिटल-ड्रॉपलेट पीसीआर आबादी के भीतर इंडेल म्यूटेशन की आवृत्ति प्रदान करेगी, लेकिन अनुक्रम के बिना, कोई यह निर्धारित नहीं कर सकता कि मौजूद इनडेल ब्याज के जीन के कार्य को संरक्षित या बाधित करने की अधिक संभावना रखते हैं या नहीं। DDPCR विधि शायद सबसे अच्छा अनुकूल है एक Cas9/gRNA आधारित ड्राइव जीव के एक क्षेत्र रिलीज परीक्षण के बाद जंगली आबादी का विश्लेषण करने के लिए क्योंकि यह कुशलता से देशी आबादी में ट्रांसजीन की शुरूआत की आवृत्ति और वास्तविक समय के करीब में आबादी के भीतर indels की पीढ़ी निर्धारित कर सकते हैं । डीडीपीसीआर क्विक टर्न-अराउंड टाइम के कारण, यदि सामग्री स्थानीय रूप से उपलब्ध थी तो साप्ताहिक रूप से एक क्षेत्र परीक्षण क्षेत्र में आबादी का नमूनाकरण करना और विश्लेषण करना संभव होगा। डीडीपीसीआर उपकरण खरीदने, आयात करने और स्थापित करने के लिए शुरू की लागत दूरदराज की प्रयोगशालाओं में उच्च होगी, लेकिन एक जंगली आबादी का कड़ाई से आकलन करने में सक्षम होने के लाभों के रूप में यह एक ड्राइव प्रणाली से संशोधन के दौर से गुजर रहा है लागत का औचित्य साबित होगा ।
The authors have nothing to disclose.
वित्त पोषण कैलिफोर्निया इरविन मलेरिया पहल विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया था । AAJ कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन में एक डोनाल्ड Bren प्रोफेसर है ।
Reagents | |||
ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
Materials | |||
ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Equipment | |||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |