Denne protokollen gir trinnene fra DNA-ekstraksjon til eksperimentelt oppsett for digital dråpe PCR (ddPCR), inkludert analyse for identifisering og kvantifisering av ikke-homologe slutt-sammenføyningshendelser (NHEJ) på målsteder etter gRNA-indusert Cas9-spalting og DNA-reparasjon. Andre bruksområder for denne metoden inkluderer applikasjoner som polymorfismedeteksjon og genredigeringsvariantverifisering.
Nylige fremskritt innen mygggenomikk og genteknologi har fremmet et behov for raske og effektive metoder for å oppdage målrettet DNA-sekvensvariasjon i stor skala. Spesielt er det viktig å oppdage innsettinger og slettinger (indels) på genredigerte steder generert av CRISPR-guiden RNA (gRNA)/Cas9-mediert ikke-homolog sluttkobling (NHEJ) for å vurdere gjengivelsen av mutagenesen og hyppigheten av utilsiktede endringer. Vi beskriver her en protokoll for digital-droplet PCR (ddPCR) som er godt egnet for NHEJ-analyse med høy gjennomstrømning. Selv om denne metoden ikke produserer data som identifiserer individuell sekvensvariasjon, gir den et kvantitativt estimat av sekvensvariasjonen i en populasjon. I tillegg, med passende ressurser, kan denne protokollen implementeres i et feltstedslaboratorium enklere enn neste generasjons eller Sanger-sekvensering. ddPCR har også en raskere snutid for resultater enn en av disse metodene, noe som gir en raskere og fullstendig analyse av genetisk variasjon i ville populasjoner under feltforsøk av genetisk konstruerte organismer.
Genstasjoner har et enormt potensial for å kontrollere insektpopulasjoner av medisinsk og landbruksrelevans1,2,3,4,5. For eksempel kan gen-drivsystemer basert på CRISPR Cas-nukleaser og guide RNAer (gRNAer) brukes til å modifisere vektor myggpopulasjoner ved å introdusere egenskaper som gir ildfasthet til malariaparasitter som fører til redusert overføring og mindre sykdom1,4,5. Gendriftssystemet kopierer seg selv og det tilhørende trekket fra ett homologt kromosom til et annet i de premetiotiske bakteriecellene, og dette sikrer at flertallet av avkomene arver stasjonen og skaper potensial for langvarig og bærekraftig befolkningsendring i feltet. En ulempe ved cas/gRNA-baserte metoder er imidlertid muligheten for å generere innsettings- og slettingsmutasjoner (indel) gjennom ikke-homolog end-joining (NHEJ) DNA-reparasjon, noe som resulterer i generering av stasjonsbestandige alleler, som når de akkumuleres til en høy nok frekvens i befolkningen, kan stoppe stasjonssystemet fra å spreseg 1,2,3,4 . Denne protokollen beskriver en høy gjennomstrømnings- og pålitelig metode som kan bestemme utbredelsen og den relative mengden indelmutasjoner, både på befolknings- og individnivå, under Cas/gRNA-basert gendrift.
Neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS) gir enestående sekvenseringsoppløsning. Kostnads- og tekniske krav knyttet til NGS forbyr imidlertid rutinemessig testing og begrenser bruken som en metode for høy gjennomstrømning for å vurdere indels6,7,8. Tradisjonelle PCR-kvantifiseringsmetoder har lenge vært brukt som standard evalueringsprosedyre for genom indels; Disse metodene er imidlertid arbeidskrevende, tar lang tid å skaffe data og har en høy grad av variasjon. Digital-Droplet PCR (ddPCR) har vist seg å være mer følsom for å oppdage mutasjoner enn Sanger-sekvensering i noen programmer og har en lavere deteksjonsgrense enn NGS i andre6,7,8,9. Dessuten er kostnaden for å vurdere et utvalgssett og snutid for å oppnå resultater billigere og raskere, henholdsvis for ddPCR enn enten Sanger-sekvensering eller NGS9. Ved hjelp av et dobbeltsondesystem identifiserer Drop-Off-analysen NHEJ-alleler basert på fraværet av wild-type (WT) sekvens på gRNA-rettet mål Cas9-kuttet sted. I denne analysen forsterkes en kort amplikon, inkludert det anslåtte kuttestedet til det Cas/gRNA-baserte systemet, med et bestemt primerpar. En fluorescerende sonde er designet for å binde seg til en bevart region av amfinen, og en annen fluorescerende sonde gjenkjenner WT-sekvensen på kuttstedet. I nærvær av et NHEJ-allel vil sistnevnte ikke binde seg til amfinen.
Bruken av ddPCR gir muligheten til å designe primere for å målrette slettinger, enkelt base-par forskjeller og innsettinger, noe som vil tillate NHEJ profilering i myggpopulasjonsanalyser9. Gitt disse attraktive funksjonene, opprettet vi en protokoll for ddPCR for høygjennomstrømningsdeteksjon av indels generert fra et Cas / gRNA-basert gendriftssystem i mygg.
Digital-droplet PCR er en effektiv metode for å bestemme tilstedeværelsen av indel alleler som følge av NHEJ hendelser i en Cas / gRNA-basert gen-drive system og tillater kvantifisering av frekvensen av disse allelene i enkeltpersoner eller populasjoner. Noen trinn i protokollen må følges med spesiell forsiktighet for å oppnå pålitelige resultater. For det første må den genomiske DNA-ekstraksjonen utføres nøye for å sikre høy kvalitet og tilstrekkelig mengde. En god ekstraksjon vil tillate nøyaktig bestemmelse av haploide genomkopier per reaksjon. Vår erfaring er at et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialfortegnelser) har gitt konsekvent DNA-ekstraksjoner av høy kvalitet. Imidlertid kan ekstraksjoner av individuelle mygg vise seg å være spesielt utfordrende, da DNA-pellet blir vanskelig å visualisere og lett kan suges opp med supernatanten hvis ikke forsiktig. For det andre må primere og sonder utformes nøye. Før du fullfører ddPCR-eksperimentet, må du sørge for at de designede primerne resulterer i et enkelt PCR-produkt ved først å utføre en tradisjonell PCR og visualisere et enkelt produkt via gelelektroforese. Referansen FAM-sonde må også utformes slik at den suppleres med en svært konservert sekvens. Dette vil sikre nøyaktige deteksjoner av WT-alleler i en mangfoldig befolkning. Primer/sondekombinasjonene for hvert unike eksperiment vil ha forskjellige termosirkuleringsforhold, og det anbefales å optimalisere disse forholdene ved hjelp av en termisk gradient.
Det finnes andre metoder for å identifisere indels, for eksempel Sanger-sekvensering eller NGS. Sangersekvensering er begrenset fordi den har en lavere grense for deteksjon og lav oppdagelseskraft for å identifisere nye varianter. Sangersekvensering er også arbeidskrevende og er ikke høy gjennomstrømning. Sammenlignet med Sanger-sekvensering har ikke NGS de samme begrensningene for lav følsomhet, oppdagelseskraft og gjennomstrømning. En annen fordel med NGS er dens evne til å oppdage en rekke mutasjoner fra enkelt nukleotidpolymorfisme (SNPer) til omorganiseringer. NGS er imidlertid en mer kostbar og tidkrevende metode for å bestemme Cas9/gRNA-tilknyttede indels fordi det bare er ett målområde av interesse, og det er best egnet for større genomomfattende analyser. Sammenlignet med de nevnte metodene, er ddPCR høy gjennomstrømning og har en rask snutid. Hvis ddPCR-materialene og instrumentene er tilgjengelige internt, kan 96 prøver behandles innen 1-2 dager, noe som gjør det godt egnet for rask analyse av store studier av Cas9 / gRNA-modifiserte organismer.
Mens det finnes mange fordeler for ddPCR, er det også begrensninger. For det første er ddPCR-utstyret ikke ofte tilgjengelig i et uavhengig laboratoriemiljø. ddPCR-utstyr kan være tilgjengelig i fellesskap ved større forskningsinstitusjoner, men dette åpner ikke for enkel datagenerering og analyse utenfor institusjonen. For det andre, i motsetning til alternativene, gir ddPCR ikke de individuelle unike sekvensene av identifiserte indelmutasjoner. Digital-droplet PCR vil gi frekvensen av indel mutasjoner i en populasjon, men uten sekvensen kan man ikke avgjøre om de indels tilstede er mer sannsynlig å bevare eller hemme funksjonen til genet av interesse. ddPCR-metoden er kanskje best egnet til å analysere ville populasjoner etter en feltutgivelsesstudie av en Cas9/gRNA-basert drivorganisme fordi den effektivt kan bestemme hyppigheten av innføring av transgene i den innfødte befolkningen og genereringen av indels i befolkningen i nær sanntid. På grunn av ddPCR rask snutid, ville det være mulig å utføre prøvetaking og analysere befolkningen i et feltforsøksområde ukentlig hvis materialer var tilgjengelige lokalt. Oppstartskostnadene for å kjøpe, importere og sette opp ddPCR-utstyret ville være høyt i eksterne laboratorier, men fordelene ved å kunne vurdere strengt en vill befolkning da det gjennomgår modifikasjon fra et drivsystem, vil rettferdiggjøre kostnadene.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen ble gitt av University of California Irvine Malaria Initiative. AAJ er professor i Donald Bren ved University of California, Irvine.
Reagents | |||
ddPCR Super Mix for Probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863024 | |
DNA extraction reagent (e.g. Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
EDTA (pH 8.0) | Invitrogen | AM9260G | |
Ethanol, 200 Proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
Isopropanol (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | A416-500 | |
Nuclei Lysis Solution (NLS) (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
PCR-grade Water | Any certified PCR-grade water can be used | ||
Protein Precipitation Solution (Wizard Genomic DNA Purification kit) | Promega | A1120 | |
Proteinase K 20 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | AM2546 | |
Materials | |||
ddPCR 96-Well Plate | Bio-Rad | 12001925 | |
Droplet Generator DG8 Cartridge and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
Droplet Generation Oil for probes | Bio-Rad | 1863005 | |
Fluorescent probes (e.g. FAM/HEX probes) | Sigma-Aldrich | N/A | Probes are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Forward and Reverse oligonucleotide primers | Sigma-Aldrich | N/A | Primers are experiment specific and can be purchased from any certified seller available. |
Equipment | |||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1851148 | Can use other Thermo cycler with gradient function and deep well |