Vi introduserer en protokoll for måling av sanntids legemiddel- og strålingsrespons av brystkreft hjernemetastatiske celler i en organotypisk hjerneskivemodell. Metodene gir en kvantitativ analyse for å undersøke de terapeutiske effektene av ulike behandlinger på hjernemetastaser fra brystkreft på en ex vivo-måte i hjernemikromiljøet.
Hjernemetastase er en alvorlig konsekvens av brystkreft for kvinner, da disse svulstene er vanskelige å behandle og er forbundet med dårlige kliniske utfall. Prekliniske musemodeller av brystkreft hjernemetastatisk (BCBM) vekst er nyttige, men er dyre, og det er vanskelig å spore levende celler og tumorcelleinvasjon i hjernen parenchyma. Presentert her er en protokoll for ex vivo hjerneskive kulturer fra xenografted mus som inneholder intracranially injisert brystkreft hjernesøkende klonale underlinjer. MDA-MB-231BR luciferase taggede celler ble injisert intracranially i hjernen til Nu / Nu kvinnelige mus, og etter tumordannelse ble hjernene isolert, skiver og dyrket ex vivo. Tumorskivene ble avbildet for å identifisere tumorceller som uttrykker luciferase og overvåke spredning og invasjon i hjernen parenchyma i opptil 10 dager. Videre beskriver protokollen bruken av tidsforløpmikroskopi for å avbilde veksten og den invasive oppførselen til tumorcellene etter behandling med ioniserende stråling eller kjemoterapi. Responsen fra tumorceller til behandlinger kan visualiseres ved levende avbildningsmikroskopi, måling av bioluminescensintensitet og utføre histologi på hjernestykket som inneholder BCBM-celler. Dermed kan denne ex vivo-skivemodellen være en nyttig plattform for rask testing av nye terapeutiske midler alene eller i kombinasjon med stråling for å identifisere legemidler som er personlig tilpasset for å målrette en individuell pasients brystkrefthjerne metastatisk vekst i hjernemikromiljøet.
Brystkreft hjernemetastaser (BCBM) utvikler seg når celler sprer seg fra den primære brystsvulsten til hjernen. Brystkreft er den nest hyppigste årsaken til hjernemetastase etter lungekreft, med metastaser som forekommer hos 10-16% av pasientene1. Dessverre forblir hjernemetastaser uhelbredelige ettersom >80% av pasientene dør innen et år etter hjernemetastasediagnosen, og deres livskvalitet er svekket på grunn av nevrologiske dysfunksjoner2. Det er et presserende behov for å identifisere mer effektive behandlingsalternativer. Monolayer todimensjonale eller tredimensjonale kulturmodeller er de mest brukte metodene for å teste terapeutiske midler i laboratoriet. Imidlertid etterligner de ikke det komplekse BCBM mikromiljøet, en stor driver for tumorfenotype og vekst. Selv om disse modellene er nyttige, fanger de ikke de komplekse tumor-stromale interaksjonene, de unike metabolske kravene og heterogeniteten til svulstene3. For mer trofast å rekapitulere tumor-stromale interaksjoner og mikromiljø heterogenitet, har vår gruppe og andre begynt å generere organotypiske hjernemetastasekulturer med pasientavledede tumorceller (primære eller metastatiske) eller kreftcellelinjer 4,5,6. Sammenlignet med klassiske in vitro-systemer, kan denne kortsiktige ex vivo-modellen gi mer relevante forhold for screening av nye terapeutiske behandlinger før preklinisk vurdering i store dyrekohorter.
Ex vivo modeller har blitt konstruert og vellykket brukt primært for identifisering av vellykkede behandlinger av ulike kreftformer. De krever få dagers vurdering og kan i tillegg skreddersys til pasientspesifikk legemiddelscreening. For eksempel har human blære og prostatakreft ex vivo vev vist en doseavhengig anti-tumor respons av docetaksel og gemcitabine7. Lignende kolorektal karsinom ex vivo vev ble utviklet for å screene kjemoterapeutiske legemidler Oxaliplatin, Cetuximab og Pembrolizumab8. Denne applikasjonen har blitt mye brukt i bukspyttkjertelkreft, med tanke på det essensielle samspillet mellom det stromale miljøet og de genotypiske og fenotypiske egenskapene til bukspyttkjertelkanal adenokarsinom 9,10. Videre er slike organotypiske modeller utviklet for lignende screeninger i hode-, nakke-, mage- og brystsvulster 11,12.
Her genereres en ex vivo hjerneskivemodell av xenografted brystkreft hjerne metastatiske tumorceller i mikromiljøet. Mus ble intracranially injisert med brystkreft hjerne metastatisk hjerne trofisk MDA-MB-231BR celler13 i cerebral cortex parietal lobe- et vanlig sted for TNBC metastasering14,15 og fikk lov til å utvikle svulster. Hjerneskiver ble generert fra disse xenografterte dyrene og opprettholdt ex vivo som organotypiske kulturer som beskrevet16,17. Denne nye ex vivo-modellen tillater analyse av BCBM-cellens vekst i hjerneparenchyma og kan brukes til å teste terapeutiske midler og strålingseffekter på tumorceller i hjernemikromiljøet.
Denne studien etablerer en ny ex vivo hjernekulturmetode for utplantede xenograft hjernesvulster. Vi viser at BCBM celler MDA-MB-231BR celler intracranially injisert i hjernen til mus kan overleve og vokse i ex vivo hjerne skiver. Studien testet også intracranially injiserte U87MG glioblastom (GBM) celler og fant også at disse kreftcellene overlever og vokser i hjerneskiver (data ikke vist). Vi tror denne modellen kan utvides utover BCBM og GBM til andre kreftformer som lett metastaser til hjernen, in…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil takke Julia Farnan, Kayla Green og Tiziana DeAngelis for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble delvis støttet av Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) og W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
6-well plates | Genessee | 25-105 | |
Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
DAPI | Invitrogen | P36935 | |
D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
Microplate Reader | Tecan Spark | ||
Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
X-ray machine | Precision 250 kVp |