השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה
Summary
מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.
Abstract
תרמוגנזה מיטוכונדריאלית (הידועה גם בשם uncoupling מיטוכונדריאלי) היא אחד היעדים המבטיחים ביותר להגדלת הוצאות האנרגיה כדי להילחם בתסמונת המטבולית. רקמות תרמוגניות כגון שומנים חומים ובז ‘מפתחות מיטוכונדריה מיוחדת מאוד לייצור חום. מיטוכונדריה של רקמות אחרות, המייצרות בעיקר ATP, ממירות גם הן עד 25% מכלל ייצור האנרגיה המיטוכונדרית לחום ולכן יכולות להשפיע באופן ניכר על הפיזיולוגיה של הגוף כולו. תרמוגנזה מיטוכונדריאלית לא רק חיונית לשמירה על טמפרטורת הגוף, אלא גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ומפחיתה את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני. מאחר שתרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת מרכזי של חילוף החומרים התאי, הבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למאבק בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. חשוב לציין שהמנגנונים המולקולריים המדויקים השולטים בהפעלה חריפה של תרמוגנזה במיטוכונדריה מוגדרים בצורה גרועה. מחסור זה במידע נובע במידה רבה ממחסור בשיטות למדידה ישירה של חלבונים שאינם מתחברים. ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיית מהדקי טלאים המיושמת על המיטוכונדריה אפשרה, לראשונה, את המחקר הישיר של התופעה במקור התרמוגנזה המיטוכונדרית, דליפת H+ דרך ה-IMM, ואת האפיון הביופיזי הראשון של מובילי מיטוכונדריה האחראים לכך, את החלבון הלא-משתף פעולה 1 (UCP1), ספציפי לשומנים חומים ובז’, ואת טרנספורטר ADP/ATP (AAC) לכל הרקמות האחרות. גישה ייחודית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים בדליפת H+ ובתרמוגנזה מיטוכונדריאלית וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם בתסמונת המטבולית. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית שלהן על ידי מדידה ישירה של זרמי H+ באמצעות ה-IMM.
Introduction
המיטוכונדריה מפורסמים בהיותם תחנת הכוח של התא. ואכן, הם המקור העיקרי לאנרגיה כימית, ATP. מה שפחות ידוע הוא כי המיטוכונדריה גם לייצר חום. למעשה, כל מיטוכונדריה מייצרת כל הזמן את שני סוגי האנרגיות (ATP וחום) ואיזון עדין בין שתי צורות האנרגיה מגדיר הומאוסטזיס של תאים מטבוליים (איור 1). כיצד המיטוכונדריה מפיצה אנרגיה בין ATP לחום היא ללא ספק השאלה הבסיסית ביותר בתחום הביו-אנרגיה, אם כי היא עדיין לא ידועה במידה רבה. אנו כן יודעים שהגדלת ייצור החום המיטוכונדריאלי (הנקראת תרמוגנזה מיטוכונדריאלית), וכתוצאה מכך הפחתת ייצור ה-ATP מגדילה את ההוצאה האנרגטית וזו אחת הדרכים הטובות ביותר להילחם בתסמונת מטבולית1.
תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מקורה בדליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית (IMM), מה שמוביל לניתוק של חמצון המצע וסינתזת ATP עם ייצור כתוצאה מכך של חום, ומכאן השם “uncoupling המיטוכונדריאלי”1 (איור 1). דליפה זו של H+ תלויה במובילים מיטוכונדריאליים הנקראים חלבונים לא משתפים פעולה (UCPs). UCP1 היה ה-UCP הראשון שזוהה. זה בא לידי ביטוי רק ברקמות תרמוגניות, שומן חום, ושומן בז ‘שבו המיטוכונדריה מתמחים בייצור חום 2,3,4. הזהות של UCP ברקמות שאינן שומן כגון שרירי השלד, הלב והכבד, נותרה שנויה במחלוקת. המיטוכונדריה ברקמות אלה יכולה להיות כ -25% מכלל האנרגיה המיטוכונדרית המומרת לחום, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על הפיזיולוגיה של כל הגוף1. מלבד שמירה על טמפרטורת הגוף הבסיסית, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה על ידי הפחתת קלוריות. בנוסף, הוא מפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי מיטוכונדריה כדי להגן על תאים מפני נזק חמצוני1. לפיכך, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מעורבת בהזדקנות תקינה, בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל ובמצבים אחרים המערבים עקה חמצונית, כגון איסכמיה-רפרפוזיה. לכן, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת רב עוצמה של חילוף החומרים התאי, והבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תקדם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות כדי להילחם בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.
נשימה מיטוכונדריאלית הייתה הטכניקה הראשונה שחשפה את התפקיד המכריע של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית בחילוף החומרים התאי והיא עדיין הפופולרית ביותר בקהילה1. טכניקה זו מבוססת על מדידת צריכת החמצן על ידי שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETC) הגוברת כאשר מופעלת דליפת H+ מיטוכונדריאלית. טכניקה זו, למרות שהיא אינסטרומנטלית, אינה יכולה לחקור באופן ישיר דליפת H+ מיטוכונדריאלית על פני IMM1, ובכך הופכת את הזיהוי והאפיון המדויקים של החלבונים האחראים לכך לקשה, במיוחד ברקמות שאינן שומן שבהן ייצור החום הוא משני בהשוואה לייצור ATP. לאחרונה, הפיתוח של טכניקת הידוק הטלאי המיושמת על המיטוכונדריה, סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ על פני כל ה-IMM ברקמות שונות 5,6,7.
מהדק הטלאים המיטוכונדריאלי של כל ה-IMM הוקם לראשונה בצורה ניתנת לשחזור על ידי Kirichok et al.8. הם תיארו את המדידה הישירה הראשונה של זרמי חד-פורטר סידן מיטוכונדריאלי (MCU) בשנת 2004 באמצעות מיטופלסטים מקווי תאים COS-78. מאוחר יותר, מעבדת קיריצ’וק הראתה זרמי סידן מהודעות מיידיות של רקמות עכבר9 ודרוזופילה 9. מעבדות אחרות משתמשות כיום באופן שגרתי בטכניקה זו כדי לחקור את התכונות הביופיזיות של MCU 10,11,12,13,14. ניתוח מדבקת IMM שלם של מוליכות אשלגן וכלוריד אפשרי גם הוא והוזכר במספר מאמרים אך עדיין לא היה הנושא העיקרי של פרסום 6,7,9. המדידה הראשונה של זרמי H+ ברחבי ה-IMM דווחה בשנת 2012 ממיטוכונדריה6 של שומן חום עכבר, וממיטוכונדריה של שומן בז’ בעכבר בשנת 20177. זרם זה נובע מחלבון ה-uncoupling הספציפי של רקמות תרמוגניות, UCP1 6,7. עבודות שפורסמו לאחרונה בשנת 2019 אפיינו את AAC כחלבון העיקרי האחראי לדליפת H+ מיטוכונדריאלית ברקמות שאינן שומן כגון הלב ושרירי השלד5.
גישה ייחודית זו מאפשרת כעת ניתוח פונקציונלי ישיר ברזולוציה גבוהה של תעלות היונים המיטוכונדריה והמובילים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. כדי להקל על הרחבת השיטה ולהשלים מחקרים אחרים כגון נשימה מיטוכונדריאלית, מתואר להלן פרוטוקול מפורט למדידת זרמי H+ הנישאים על ידי UCP1 ו- AAC. שלושה שלבים חשובים מתוארים: 1) בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום עכברי כדי לנתח זרם H+ תלוי UCP1 ובידוד מיטוכונדריאלי מהלב כדי לנתח זרם H+ תלוי AAC, 2) הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של הממברנה המיטוכונדרית החיצונית (OMM), 3) הקלטות מהדק טלאי של זרמי UCP1 ו-H+ התלויים ב-AAC על פני כל ה-IMM.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר שיטה זה נועד להציג את טכניקת מהדק הטלאי שיושמה לאחרונה על המיטוכונדריה, גישה חדשה לחקר ישיר של דליפת H+ דרך ה-IMM האחראית על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית 5,6,7,15. טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות וניתן להשתמש בה גם כדי לנת?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני מודה לד”ר יורי קיריצ’וק על המדע הגדול שהייתי חלק ממנו במעבדתו ולחברי מעבדת קיריצ’וק על הדיונים המועילים. אני מודה גם לד”ר דאגלס ס. וואלאס על שסיפק עכברי נוקאאוט AAC1 . מימון: A.M.B נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של איגוד הלב האמריקאי 19CDA34630062.
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Riferimenti
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
