ミトコンドリアの熱発生能力を研究するためのパッチクランプ技術の使用
Summary
この方法の記事では、ミトコンドリアの熱生成能力を研究するための新しいアプローチであるパッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るH+ リークを測定する主な手順を詳述します。
Abstract
ミトコンドリア熱発生(ミトコンドリアアンカップリングとしても知られている)は、メタボリックシンドロームと戦うためのエネルギー消費を増加させるための最も有望な標的の1つである。茶色脂肪やベージュ脂肪などの熱発生組織は、熱産生のために高度に専門化されたミトコンドリアを発達させる。主にATPを産生する他の組織のミトコンドリアも、ミトコンドリア全体のエネルギー産生の最大25%を熱に変換し、したがって、全身の生理機能に大きな影響を与える可能性があります。ミトコンドリア熱発生は、体温を維持するために不可欠であるだけでなく、食事誘発性肥満を予防し、活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する。ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の重要な調節因子であるため、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発に役立つであろう。重要なことに、ミトコンドリアにおける熱発生の急性活性化を制御する正確な分子機構は、あまり定義されていない。この情報の欠如は、主に、結合解除タンパク質を直接測定する方法が不足しているためです。ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の最近の開発により、ミトコンドリア熱発生の起源における現象、IMMを介したH+ リークの直接研究が初めて可能になり、それを担うミトコンドリアトランスポーター、褐色およびベージュ色の脂肪に特異的な脱共役タンパク質1(UCP1)、および他のすべての組織に対するADP / ATPトランスポーター(AAC)の最初の生物物理学的特徴付けが可能になった。このユニークなアプローチは、H+ リークとミトコンドリア熱発生を制御するメカニズムと、メタボリックシンドロームと戦うためにそれらをどのように標的にすることができるかについての新しい洞察を提供します。この論文では、IMMを通るH+ 電流を直接測定することによってミトコンドリアの熱発生能力を研究するためにミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論について説明します。
Introduction
ミトコンドリアは細胞の原動力として有名です。実際、それらは化学エネルギーの主要な供給源であるATPです。あまり知られていないのは、ミトコンドリアも熱を発生するということです。実際、すべてのミトコンドリアは常に2種類のエネルギー(ATPと熱)を生成し、2つのエネルギー形態の微妙なバランスが代謝細胞の恒常性を定義します(図1)。ミトコンドリアがATPと熱の間でどのようにエネルギーを分配するかは、生体エネルギー学の分野では確かに最も基本的な問題ですが、まだほとんど知られていません。ミトコンドリア熱産生(ミトコンドリア熱発生と呼ばれる)を増加させ、その結果ATP産生を減少させるとエネルギー消費が増加することが知られており、これはメタボリックシンドローム1と戦うための最良の方法の1つです。
ミトコンドリア熱発生は、ミトコンドリア内膜(IMM)を横切るH+リークに由来し、基質酸化の脱結合とATP合成、その結果生じる熱の生成につながるため、「ミトコンドリアアンカップリング」1という名前が付けられています(図1)。このH+リークは、アンカップリングタンパク質(UCP)と呼ばれるミトコンドリアトランスポーターに依存します。UCP1 は最初に同定された UCP でした。それは、ミトコンドリアが熱産生に特化している熱発生組織、褐色脂肪、およびベージュ脂肪でのみ発現される2,3,4。骨格筋、心臓、肝臓などの非脂肪組織におけるUCPの同一性は、依然として議論の余地がある。これらの組織におけるミトコンドリアは、全ミトコンドリアエネルギーの約25%を熱に変換することができ、これは全身の生理機能に大きな影響を与える可能性がある1。深部体温を維持することに加えて、ミトコンドリア熱発生はまた、カロリーを減らすことによって食事誘発性肥満を防ぎます。さらに、ミトコンドリアによる活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する1。したがって、ミトコンドリア熱発生は、正常な老化、加齢性変性障害、および虚血再灌流などの酸化ストレスを伴う他の状態に関与する。したがって、ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の強力な調節因子であり、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発を促進するであろう。
ミトコンドリア呼吸は、細胞代謝におけるミトコンドリア熱発生の重要な役割を明らかにした最初の技術であり、コミュニティ1で依然として最も人気があります。この技術は、ミトコンドリアH+リークが活性化されると増加するミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)による酸素消費量の測定に基づいています。この技術は、道具的ではあるが、IMM 1を横切るミトコンドリアH+リークを直接研究することはできないため、特にATP産生と比較して熱産生が二次的である非脂肪組織において、IMM1の原因となるタンパク質の正確な同定および特性評価を困難にする。最近、ミトコンドリアに適用されるパッチクランプ技術の開発は、様々な組織におけるIMM全体にわたるH+リークの最初の直接研究を提供しました5、6、7。
IMM全体のミトコンドリアパッチクランプは、Kirichokらによって再現可能な方法で最初に確立された8。彼らは、2004年にCOS-7細胞株8からのミトプラストを用いてミトコンドリアカルシウムユニポーター(MCU)電流の最初の直接測定を説明した。その後、Kirichok研究室は、マウス9およびショウジョウバエ組織9のIMMからのカルシウム電流を示した。他の研究室は現在、MCU10、11、12、13、14の生物物理学的特性を研究するためにこの技術を日常的に使用しています。カリウムと塩化物のコンダクタンスのIMMパッチクランプ分析も可能であり、いくつかの論文で言及されていますが、まだ出版物6、7、9の主な主題ではありません。IMMを横切るH+電流の最初の測定は、2012年にマウスの褐色脂肪ミトコンドリア6から、そして2017年にマウスベージュ脂肪ミトコンドリアから報告されました7。この電流は、熱発生組織の特異的な脱共役タンパク質、UCP1 6,7によるものである。2019年に発表された最近の研究では、AACが心臓や骨格筋などの非脂肪組織におけるミトコンドリアH+リークの原因となる主なタンパク質として特徴付けられました5。
このユニークなアプローチにより、ミトコンドリアの熱発生を担うミトコンドリアイオンチャネルとトランスポーターの直接高分解能機能解析が可能になりました。この方法の拡大を促進し、ミトコンドリア呼吸などの他の研究を補完するために、UCP1およびAACによって運ばれるH+ 電流を測定するための詳細なプロトコルを以下に説明する。1)UCP1依存性H+ 電流を分析するためのマウス褐色脂肪からのミトコンドリア単離およびAAC依存性H+ 電流を分析するための心臓からのミトコンドリア単離、2)外側ミトコンドリア膜(OMM)の機械的破裂のためのフレンチプレスによるミトプラストの調製、3)IMM全体にわたるUCP1およびAAC依存性H+ 電流のパッチクランプ記録。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法の記事は、ミトコンドリア熱発生を担当するIMMを介したH+リークを直接研究する新しいアプローチであるミトコンドリアに最近適用されたパッチクランプ技術を提示することを目的としています5,6,7,15。この技術は組織に限定されず、HAP1、COS7、C2C12、MEF細胞などの異なる標準ヒト…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私が彼の研究室で参加した素晴らしい科学について、ユーリー・キリコック博士と、有益な議論をしてくれたキリコック研究所のメンバーに感謝します。また、 AAC1 ノックアウトマウスを提供してくれたダグラス・C・ウォレス博士にも感謝します。 資金調達:AMBは、米国心臓協会キャリア開発賞19CDA34630062の支援を受けました。
Materials
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
Riferimenti
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