포유류 세포에서 내구 재활용을 조사하기 위한 밀도 그라데이션 초원심 분리
Summary
이 논문은 자당 밀도 그라데이션 초원심 분리를 사용하여 포유류 세포에서 종양을 재활용하는 것을 준비하기위한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.
Abstract
내적 인신 매매는 광범위한 생물학적 사건을 규제하는 필수적인 세포 과정입니다. 단백질은 플라즈마 막에서 내면화된 다음 초기 내분으로 운반됩니다. 내부화된 단백질은 분해를 위해 리소솜으로 이동하거나 플라즈마 멤브레인으로 다시 재활용될 수 있습니다. 강력한 내세포 재활용 경로는 내분비증에서 멤브레인 물질의 제거의 균형을 위해 필요합니다. 다양한 단백질은 ADP-리보실화 인자 6(ARF6)을 포함하는 통로를 조절하는 것으로 보고된다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 세포 분획을 위한 고전적인 방법입니다. 원심분리 후, 세포기관은 이소피닉 표면에 퇴적됩니다. 분수는 다른 다운스트림 응용 프로그램에 수집되고 사용됩니다. 여기에 기재된 프로토콜은 밀도 그라데이션 초원심분리를 사용하여 전감염된 포유류 세포로부터 내분 함유 분획을 재활용하는 프로토콜이다. 격리된 분획은 단백질 함량을 분석하기 위한 표준 서양 블로팅을 실시하였다. 이 방법을 채택함으로써, 우리는 ras 관련 C3 보툴리눔 독소 기판 1 (Rac1) 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자인 삼장 막표적이 ARF6 매개 내분비성 재활용을 통해 확인하였다.
Introduction
내피 인신 매매는 다양한 생물학적 사건1,예를 들어 신호 수용체, 이온 채널 및 접착 분자의 운송을 연루시키는 필수적인 생리학적 과정입니다. 플라즈마 멤브레인에서 국소화된 단백질은 내분비2에 의해 내면화된다. 내부화된 단백질은 초기 내분3에의해 정렬됩니다. 단백질 중 일부는 분해4용리소좀을 대상으로 한다. 그러나, 단백질의 상당수는 빠른 재활용 및 느린 재활용 프로세스에 의해 세포 표면으로 다시 재활용됩니다. 빠른 재활용에서 단백질은 초기 내분모를 떠나 플라즈마 막으로 직접 돌아갑니다. 반대로, 느린 재활용에서 단백질은 먼저 내막 재활용 구획으로 분류된 다음 다시 플라즈마 멤브레인으로 운반됩니다. 다양한 화물 단백질은 예를 들어, 클래트린, 레트로머 복합체, 리트리버 복합체 및 Wiskott-Aldrich 증후군 단백질 및 SCAR 호모글로그(WASH) 복합체, 이러한 멤브레인 재활용공정4,5,6,7,8,9에참여한다. 내분비및 재활용 이벤트의 균형은 세포 생존에 매우 중요하며, 예를 들어 세포 접착, 세포 이동, 세포 극성 및 신호 변환과 같은 다양한 세포이벤트(10)에기여합니다.
ARF6, 작은 GTPase, 내피 인신 매매의 보고 된 레귤레이터7,11,12. 관심있는, 다양한 연구 그룹은 내용 재활용13,14,15,16,17에서ARF6의중요성을설명했다. 이 연구는 ARF6 매개 중성염 아웃성장과 내세포 재활용 사이의 관계를 조사하는 것을 목표로합니다. 이전 보고서는 ARF6의 활성화가 사이토카네시스 1 (DOCK180) 복합18의ELMO1-헌납기에 작용하여 Rac1 활동에 상류되는 것을 시사한다. 그러나 ARF6가 ELMO1-DOCK180 중재 된 Rac1 신호를 어떻게 유발하는지는 불분명합니다. 밀도 그라데이션 초원심분리는 이러한 과정에서 ARF6 매개 내막 재활용의 역할을 조사하기 위해 사용되었다. 이를 이용하여, 재활용 내성 함유 분획은세포용액(19)으로부터수득하였다. 분획은 단백질 함량 분석을 위한 서양 블로팅을 실시하였다. 면역블롯 결과는 FE65, 뇌가 풍부한 어댑터 단백질의 존재 하에서 활성 ARF6가 실질적으로 내모성 함유 분획을 재활용하는 ELMO1의 수준을 증가시켰다는 것을 밝혔습니다. 다음 프로토콜은 포유류 세포를 (1) 횡단하는 절차에 대한 절차를 포함한다; (2) 샘플 및 밀도 그라데이션 컬럼을 준비; 및 (3) 재활용 내분 함유 분획을 획득한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜은 초원심분리에 의한 배양된 세포로부터의 재활용 내모를 분리하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 방법의 신뢰성은 최신간행물(22)에의해 입증되었으며, 재활용 내성들이 골기 장치 및 미토콘드리아와 같은 다른 세포기관으로부터 성공적으로 분리되었음을 입증하였다(그림1). 좋은 분리 결과를 얻기 위해 몇 가지 중요한 단계는주의를 기?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 연구 보조금 위원회 홍콩, CUHK 직접 보조금 제도, 유나이티드 대학 인다우먼트 기금 및 TUYF 자선 신탁의 기금으로 지원되었습니다. 이 작품의 수치는 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 “ARF6-Rac1 시그널링 매개 중계 중성염 아웃성장이 2020년 10월 FASEB 저널에 발표된 ARF6 6 및 ELMO1을 통해 뉴런 어댑터 FE65에 의해 전능적이다”라는 이전 간행물에서 채택되었습니다.
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
Riferimenti
- Elkin, S. R., Lakoduk, A. M., Schmid, S. L. Endocytic pathways and endosomal trafficking: a primer. Wiener Medizinische Wochenschrift. 166 (7-8), 196-204 (2016).
- Kumari, S., Mg, S., Mayor, S. Endocytosis unplugged: multiple ways to enter the cell. Cell Research. 20 (3), 256-275 (2010).
- Naslavsky, N., Caplan, S. The enigmatic endosome – sorting the ins and outs of endocytic trafficking. Journal of Cell Science. 131 (13), (2018).
- Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 679-696 (2018).
- Weeratunga, S., Paul, B., Collins, B. M. Recognising the signals for endosomal trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 65, 17-27 (2020).
- Khan, I., Steeg, P. S. Endocytosis: a pivotal pathway for regulating metastasis. British Journal of Cancer. 124 (1), 66-75 (2021).
- Grant, B. D., Donaldson, J. G. Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (9), 597-608 (2009).
- Maxfield, F. R., McGraw, T. E. Endocytic recycling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (2), 121-132 (2004).
- McDonald, F. J. Explosion in the complexity of membrane protein recycling. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (4), 483-494 (2021).
- O’Sullivan, M. J., Lindsay, A. J. The Endosomal Recycling pathway-at the crossroads of the cell. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6074 (2020).
- D’Souza-Schorey, C., Li, G., Colombo, M. I., Stahl, P. D. A regulatory role for ARF6 in receptor-mediated endocytosis. Science. 267 (5201), 1175-1178 (1995).
- Schweitzer, J. K., Sedgwick, A. E., D’Souza-Schorey, C. ARF6-mediated endocytic recycling impacts cell movement, cell division and lipid homeostasis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 22 (1), 39-47 (2011).
- Finicle, B. T., et al. Sphingolipids inhibit endosomal recycling of nutrient transporters by inactivating ARF6. Journal of Cell Science. 131 (12), (2018).
- Lu, H., et al. APE1 upregulates MMP-14 via redox-sensitive ARF6-mediated recycling to promote cell invasion of esophageal adenocarcinoma. Ricerca sul cancro. 79 (17), 4426-4438 (2019).
- Qi, S., et al. Arf6-driven endocytic recycling of CD147 determines HCC malignant phenotypes. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 38 (1), 471 (2019).
- Crupi, M. J. F., et al. GGA3-mediated recycling of the RET receptor tyrosine kinase contributes to cell migration and invasion. Oncogene. 39 (6), 1361-1377 (2020).
- Gamara, J., et al. Assessment of Arf6 deletion in PLB-985 differentiated in neutrophil-like cells and in mouse neutrophils: impact on adhesion and migration. Mediators of Inflammation. 2020, 2713074 (2020).
- Santy, L. C., Ravichandran, K. S., Casanova, J. E. The DOCK180/Elmo complex couples ARNO-mediated Arf6 activation to the downstream activation of Rac1. Current Biology. 15 (19), 1749-1754 (2005).
- Wibo, M., Dumont, J. E., Brown, B. L., Marshall, N. J. Cell fractionation by centrifugation methods. Eukaryotic Cell Function and Growth: Regulation by Intracellular Cyclic Nucleotides. , 1-17 (1976).
- Kelly, E. E., Horgan, C. P., McCaffrey, M. W. Rab11 proteins in health and disease. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1360-1367 (2012).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. The Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Chan, W. W. R., Li, W., Chang, R. C. C., Lau, K. F. ARF6-Rac1 signaling-mediated neurite outgrowth is potentiated by the neuronal adaptor FE65 through orchestrating ARF6 and ELMO1. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (12), 16397-16413 (2020).
- Huber, L. A., Pfaller, K., Vietor, I. Organelle proteomics: implications for subcellular fractionation in proteomics. Circulation Research. 92 (9), 962-968 (2003).
- Fleischer, S., Kervina, M. Subcellular fractionation of rat liver. Methods in Enzymology. 31, 6-41 (1974).
- Marsh, M. Endosome and lysosome purification by free-flow electrophoresis. Methods in Cell Biology. 31, 319-334 (1989).
- Stasyk, T., Huber, L. A. Zooming in: fractionation strategies in proteomics. Proteomics. 4 (12), 3704-3716 (2004).
- Iordachescu, A., Hulley, P., Grover, L. M. A novel method for the collection of nanoscopic vesicles from an organotypic culture model. RSC Advances. 8 (14), 7622-7632 (2018).
- Chavrier, P., vander Sluijs, P., Mishal, Z., Nagelkerken, B., Gorvel, J. P. Early endosome membrane dynamics characterized by flow cytometry. Cytometry. 29 (1), 41-49 (1997).
- Chasan, A. I., Beyer, M., Kurts, C., Burgdorf, S. Isolation of a specialized, antigen-loaded early endosomal subpopulation by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 960, 379-388 (2013).
- Thapa, N., et al. Phosphatidylinositol-3-OH kinase signaling is spatially organized at endosomal compartments by microtubule-associated protein 4. Nature Cell Biology. 22 (11), 1357-1370 (2020).
- Guimaraes de Araujo, M. E., Fialka, I., Huber, L. A. . Endocytic Organelles: Methods For Preparation And Analysis. In eLS. , (2001).
- Rickwood, D., Graham, J. . Centrifugation Techniques. , (2015).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of macrophage early and late endosomes by latex bead internalization and density gradient centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (12), (2015).
- Urbanska, A., Sadowski, L., Kalaidzidis, Y., Miaczynska, M. Biochemical characterization of APPL endosomes: the role of annexin A2 in APPL membrane recruitment. Traffic. 12 (9), 1227-1241 (2011).
