哺乳類細胞におけるエンドサイトリサイクルを調べた密度勾配超遠心分離
Summary
本論文は、ショ糖密度勾配超遠心化を用いて哺乳動物細胞からの子宮体をリサイクルする方法を提示することを目的とする。
Abstract
内皮の人身売買は、生物学的事象の広い範囲を調節する不可欠な細胞プロセスです。タンパク質は、原形質膜から内在化し、初期の子宮間体に輸送されます。インターロナイズされたタンパク質は、分解のためにリソソームに通過したり、細胞膜にリサイクルすることができます。エンドサイトーシスからの膜材料の除去のバランスをとるためには、堅牢なエンドサイト循環型の循環経路が必要です。ADP-リボシル化因子6(ARF6)を含む様々なタンパク質が経路を調節すると報告されている。密度勾配超遠心分離は、細胞分画の古典的な方法である。遠心分離後、オルガネラはイソピクセンの表面で沈み込む。分数は収集され、他のダウンストリーム・アプリケーションに使用されます。ここで説明するプロトコルは、密度勾配超遠心分離を用いて、トランスフェクションされた哺乳動物細胞からendosome含有分率をリサイクルして得るプロトコルである。単離された分画を、それらのタンパク質内容物を分析するための標準的なウエスタンブロッティングを行った。この方法を用いることで、Ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(Rac1)グアニンヌクレオチド交換因子である巻込みおよび細胞運動性1(ELMO1)の細胞膜ターゲティングが、ARF6媒介性エンドサイトリサイクルを介してであることを同定した。
Introduction
内経性の人身売買は、様々な生物学的事象1、例えば、シグナル伝達受容体、イオンチャネル、および接着分子の輸送を含む必須の生理学的プロセスである。血漿膜に局在するタンパク質は、エンドサイトーシス2によって内在化される。その後、内部化されたタンパク質は初期の内期3によってソートされる。タンパク質の一部は分解のためにリソソームを標的としている。しかし、大量のタンパク質は、高速リサイクルと低速リサイクルプロセスによって細胞表面にリサイクルされます。高速リサイクルでは、タンパク質は初期の子宮体を離れ、原形質膜に直接戻ります。逆に、遅いリサイクルでは、タンパク質はまずエンドサイトリサイクルコンパートメントに分類され、次に形質膜に戻されます。種々のカーゴタンパク質は、例えば、クラトリン、レトロマー複合体、レトリバー複合体及びウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質、及びSCARホモローグ(WASH)複合体、4、5、6、7、8、9等の膜リサイクルプロセスに関与する。エンドサイトーシスとリサイクルイベントのバランスは、細胞の生存に不可欠であり、例えば、細胞接着、細胞移動、細胞極性、およびシグナル伝達などの様々な細胞事象10に寄与する。
ARF6は、小さなGTPaseで、内視鏡7、11、12の報告されたレギュレータです。関心のある研究グループは、内視鏡リサイクルにおけるARF6の重要性を図示しています13,14,15,16, 17.この研究は、ARF6媒介性神経突起成長とエンドサイトリサイクルとの関係を調査することを目的としている。前の報告は、ARF6の活性化がサイトカネシス1(DOCK180)複合体18のELMO1-ディディケーターに作用してRac1活性に上流であることを示唆している。しかし、ARF6がどのようにELMO1-DOCK180仲介Rac1シグナリングを引き起こすかは不明です。このような過程におけるARF6媒介型エントサイトリサイクルの役割を調査するために、密度勾配超遠心分離が採用された。それを用いることによって、細胞ライセート19から循環性のendosome含有分率が得られた。分画を、タンパク質含量分析用のウェスタンブロッティングを行った。免疫ブロットの結果は、脳に富んだアダプタータンパク質であるFE65の存在下で、活性ARF6が、エンドーソーム含有分率のリサイクルにおけるELMO1のレベルを実質的に増加させたことを明らかにした。以下のプロトコルには、(1)哺乳類細胞をトランスフェクトするための手順が含まれています。(2) サンプルと密度勾配列の準備(3)循環性のendosome含有分率を得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
上記のプロトコルは、超遠心分離によって培養細胞から培養された細胞から循環性の内生体を単離するための手順を概説する。この方法の信頼性は最新の刊行22によって実証されており、リサイクル用のエンドーソームがゴルジ装置やミトコンドリアなどの他のオルガネラ(図1)から正常に分離されていることを証明している。いくつかの重要なステッ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、研究助成金評議会香港、CUHK直接助成金制度、ユナイテッド・カレッジ・エンダウメント・ファンド、TUYF慈善信託からの資金によって支えられました。この研究の数字は、2020年10月にFASEBジャーナルに掲載された「ARF6-Rac1シグナル伝達性神経突起伸長は、ARF6とELMO1のオーケストレーションを通じてニューロンアダプタFE65によって増強される」と述べた。
Materials
| 1 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube, 11 x 34 mm | Beckman Coulter | 347287 | |
| 100 mm tissue culture dish | SPL | 20100 | |
| 13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | C14277 | |
| 5x Sample Buffer | GenScript | MB01015 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| COX IV (3E11) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4850S | Rabbit monoclonal antibody for detecting COX IV. |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| Dounce Tissue Grinder, 7 mL | DWK Life Sciences | 357542 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with low glucose | HyClone | SH30021.01 | |
| ELMO1 antibody (B-7) | Santa Cruz Biotechnology | SC-271519 | Mouse monoclonal antibody for detecting ELMO1. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| FE65 antibody (E-20) | Santa Cruz Biotechnology | SC-19751 | Goat polyclonal antibody for detecting FE65. |
| Fetal Bovine Serum, Research Grade | HyClone | SV30160.03 | |
| GAPDH Monoclonal Antibody (6C5) | Ambion | AM4300 | Mouse monoclonal antibody for detecting GAPDH. |
| ImageLab Software | Bio-Rad | Measurement of band intensity | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Monoclonal Anti-β-COP antibody | Sigma | G6160 | Mouse monoclonal antibody for detecting β-COP. |
| Myc-tag (9B11) mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2276S | Mouse monoclonal antibody for detecting myc tagged proteins. |
| OmniPur EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Calbiochem | 4010-OP | |
| Optima L-100 XP | Beckman Coulter | 392050 | |
| Optima MAX-TL | Beckman Coulter | A95761 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | Gibco | 31985070 | |
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| RAB11A-Specific Polyclonal antibody | Proteintech | 20229-1-AP | Rabbit polyclonal antibody for detecting Rab11. |
| Sucrose | Affymetrix | AAJ21931A4 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| TLA-120.2 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 362046 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 |
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