En automatiserad mikroskopisk poängsättningsmetod för γ-H2AX Foci-analys hos humana perifera blodlymfocyter

Summary

Detta protokoll presenterar bildberedning och automatiserad poängsättning av γ-H2AX foci assay på perifera blod lymfocyter. För att illustrera analysens metod och känslighet bestrålades isolerade lymfocyter in vitro. Denna automatiserade metod för DNA DSB-detektion är användbar för snabba och höggenomströmningsbiologiska dosimetriapplikationer.

Abstract

Joniserande strålning är en potent inducerare av DNA-skador och ett väldokumenterat cancerframkallande ämne. Biologisk dosimetri omfattar påvisande av biologiska effekter som orsakas av exponering för joniserande strålning för att göra en individuell dosbedömning. Detta är relevant inom ramen för strålningskriser, där hälsobedömningar och planering av klinisk behandling för utsatta offer är avgörande. Eftersom DNA-dubbelsträngsbrytningar (DSB) anses vara den dödligaste formen av strålningsinducerad DNA-skada, presenterar detta protokoll en metod för att upptäcka DNA DSB i blodprover. Metoden bygger på detektion av ett fluorescerande märkt fosforylerat DNA-reparationsprotein, nämligen γ-H2AX. Användningen av en automatiserad mikroskopiplattform för att poängsätta antalet γ-H2AX-foci per cell möjliggör en standardiserad analys med en betydande minskning av turn-around-tiden. Därför har γ-H2AX-analysen potential att vara en av de snabbaste och känsliga analyserna för biologisk dosimetri. I detta protokoll kommer helblodsprover från friska vuxna frivilliga att bearbetas och bestrålas in vitro för att illustrera användningen av den automatiserade och känsliga γ-H2AX foci assay för biodosimmetriapplikationer. Ett automatiserat slide scanning system och analysplattform med ett integrerat fluorescensmikroskop används, vilket möjliggör snabb, automatisk poängsättning av DNA DSB med en minskad grad av partiskhet.

Introduction

Sedan upptäckten har joniserande strålning (IR) blivit ett oumbärligt verktyg i nuvarande medicinska och industriella metoder, liksom i jordbruks- och militära tillämpningar. Men den breda användningen av IR ökar också risken för överexponering av strålning för både professionella strålningsarbetare och allmänheten. IR är ett välkänt fysiskt cancerframkallande ämne som kan inducera DNA-skador på ett direkt eller indirekt sätt, vilket leder till betydande hälsorisker ^1,2. Därför är det viktigt att göra en dosbedömning, eftersom exponeringsgraden utgör ett viktigt första steg i hanteringen av strålningsolyckan ¹.

I händelse av storskaliga nukleära eller radiologiska nödsituationer kan antalet dosbedömningar som behöver utföras variera från några till tusentals människor beroende på olyckans storlek³. I dessa scenarier kan fysisk dosimetri också vara tvetydig (t.ex. om dosimetern inte bärs korrekt) eller inte är tillgänglig, när allmänheten är involverad. Medan kliniska symtom kan användas för triage, de är inte nödvändigtvis strålningsspecifika och kan resultera i en falsk diagnos. Därför är det lämpligt att använda biologisk dosimetri tillsammans med fysisk dosimetri och kliniska bedömningar. Denna metod möjliggör analys av strålningsinducerade förändringar på cellnivå och möjliggör otvetydig identifiering av exponerade individer som behöver medicinsk behandling⁴. Läkaren kan sedan använda denna biologiska dosbedömning för att komplettera fysiska dosrekonstruktioner och andra kliniska diagnoser, för att förskriva lämplig medicinsk vård⁵. Behovet av biologisk dosimetri kommer att vara särskilt stort för triage och medicinsk hantering av offer när exponeringsscenariot inte är välkänt och när offren är medlemmar av allmänheten. Huvudsyftet med triage är att effektivt skilja “oroliga väl” personer, som kan ha prodromala symtom men som inte fick en hög dos, från utsatta personer som behöver omedelbar medicinsk hjälp och specialiserad vård. Den tröskelnivå för stråldos som kan orsaka strålningssjuka är cirka 0,75 – 1,00 Gy. Sedan löper de individer som får > 2 Gy av exponering högre risk för akut strålningssyndrom och bör få snabb medicinsk behandling^6,7. Uppskattningar av biologiska doser i rätt tid för offer som fastnat i korselden av sådana katastrofer är avgörande. Dessutom kan det också trösta och lugna minimalt utsatta offer⁸.

Strålskyddsmyndigheterna använder olika biodosimmetrimarkörer, som huvudsakligen är baserade på påvisande av cytogenetiska skador, såsom dicentriska kromosomer eller mikrokärnor, i odlade mänskliga lymfocyter⁹. Detektion av cytogenetiska skador kan också utföras genom fluorescerande in situ hybridisering (FISH) flyttningsanalys¹⁰. Den största nackdelen med de konventionella cytogenetiska metoderna är dock den långa leveranstiden för att få resultaten i en nödsituation⁸.

Ett av de tidigaste stegen i DNA DSB-igenkänningsprocessen är fosforylering av histonvarianten H2AX, vilket leder till bildandet av γ-H2AX och efterföljande rekrytering av reparationsfaktorer. Under det senaste decenniet har detektion av strålningsinducerade γ-H2AX-högborgar i perifera blodlymfocyter med immunofluorescensmikroskopi fått växande uppmärksamhet som ett tillförlitligt biologiskt dosimetriverktyg^{11,12,13,14,15}. Beroende på strålningskvalitet och celltyp detekteras maximalt utbyte av γ-H2AX-högborgar inom 0,5- 1 timme efter bestrålning^16,17. Det förväntas att det finns ett nära samband mellan antalet DNA DSB och γ-H2AX-högborgar, liksom mellan försvinnandet av högborgar och DSB-reparation. Lasersaxexperiment med en pulserad lasermikroberam har visat att γ-H2AX-foci lokaliseras till platserna för DNA DSB¹⁸. Även om det fortfarande är ett ämne för aktiv debatt, föreslog en av de tidigaste studierna med ¹²⁵jag en 1-till-1-korrelation mellan det beräknade antalet sönderfall per cell (som kan representeras för antalet strålningsinducerade DNA DSB) och antalet γ-H2AX-högborgar som fick^19,20.

Under det senaste decenniet har Europeiska unionen finansierat multibiodoseprojekten (tvärvetenskapliga biodosimetriska verktyg för att hantera storskaliga radiologiska olyckor) och RENEB-projekt (Realizing the European Network of Biodosimetry) för att skapa ett hållbart nätverk inom biologisk och retrospektiv dosimetri^21,22. Detta projekt omfattade olika laboratorier i hela Europa för att utvärdera beredskapskapaciteten i händelse av en radiologisk nödsituation^14,21,22. Den γ-H2AX foci-analysen har ett antal betydande fördelar, såsom en snabb bearbetningstid, potentialen för batchbearbetning som möjliggör hög genomströmning samt dess höga känslighet om den används inom några timmar efter exponering^13,23,24. Den höga känsligheten hos analysen i lågdosintervallet resulterade i ett antal studier där γ-H2AX foci assay användes som en indikator på effekten av medicinsk strålningsexponering, både i strålbehandling och i diagnostiska bildbehandlingstillämpningar^{25,26,27,28,29,30}. Dessa egenskaper gör γ-H2AX foci assay ett mycket konkurrenskraftigt alternativ till andra metoder för tidig triage i stora kärnkraftsolyckor för att skilja de kritiskt exponerade från lågriskpersoner. Flera optimeringsexperiment har visat att det är möjligt att utföra γ-H2AX foci assay med små volymer blod, såsom studien av Moquet et al. som rapporterade att det är möjligt att utföra γ-H2AX foci assay med endast en droppe blod (fingerstick)³¹. Ett liknande tillvägagångssätt användes vid utvecklingen av det helautomatiska rabit-systemet (Rapid Automated Biodosimetry Tool) som optimerades för att mäta γ-H2AX-utbyten från fingersticksbaserade blodprover^32,33. Sammantaget tyder resultaten från multibiodose- och RENEB-interjämförelsestudierna på att γ-H2AX-foci assay kan vara ett mycket användbart triageverktyg efter en nyligen (upp till 24 timmar) akut strålningsexponering^12,13,14. I en interjämförelsestudie med låg doshalt kan en dos så låg som 10 mGy särskiljas från de sham-bestrålade kontrollproverna, vilket belyser analysens känslighet i lågdosintervallet³⁴. Det är viktigt att notera att analysens höga känslighet är särskilt sant för lymfocyter, vilket gör dem till en av de lämpligaste celltyperna för utvärdering av lågdosexponeringar. Lymfocyter är huvudsakligen icke-cyklande celler och representerar en synkron population. Det senare undviker uttryck av γ-H2AX är associerad med DNA-replikation, vilket avsevärt minskar analysens känslighet för att detektera strålningsinducerad DSB under G2- och S-fasen av cellcykeln³⁵. Förutom dess känslighet för låga doser för lymfocyter är vändningstiden för γ-H2AX foci assay betydligt snabbare än cytogenetiska tekniker som dicentrisk och mikronukleosanalys, eftersom det inte kräver stimulering av lymfocyter. Därför kan resultat erhållas inom några timmar jämfört med ett par dagar för cytogenetiska tekniker. En stor nackdel med analysen är det snabba försvinnandet av γ-H2AX-focisignalen, som normalt reduceras till baslinjenivåer inom några dagar efter strålningsexponeringen beroende på DNA-reparationskinetiken³⁶. Därför är den mest lämpliga tillämpningen av analysen i ett biodosimmetri sammanhang för inledande triage ändamål och att prioritera mer tidskrävande cytogenetiska biologiska dosimetri uppföljning för vissa offer. För exakta retrospektiva biodosimmetri och långsiktiga effekter måste man dock förlita sig på cytogenetiska tekniker som trefärgs FISH-analyser för detektion av stabila kromosomavvikelser om exponeringen ägde rum för flera år sedan.¹⁰.

Som en del av flera initiativ för biodosimmetri har flera analyser utvärderats för triageändamål bredvid γ-H2AX-foci-analys för att triagera människor i storskaliga radiologiska nödsituationer. såsom dicentricsanalys, cytokinesblockets mikronukleusanalys, elektronparamagnetisk resonans (EPR), serumproteinanalys (SPA), hudfläcksanalys (SSA), optiskt stimulerad luminiscens (OSL) samt genuttrycksanalys ^37,38. Den γ-H2AX foci-analysen kan användas kvantitativt för utvärdering av DNA DSB-bildning och reparation³⁹. Analysen är dock tidsberoende eftersom nivån på γ-H2AX-högborgar varierar med tiden efter bestrålning på grund av DNA DSB-reparationskinetiken⁴⁰. En jämförande studie visade att mikroskopisk poängsättning med z-steg kapacitet erbjuder de mest exakta resultaten efter 1 Gy av bestrålning, medan flödescytometri endast ger tillförlitliga resultat vid högre doser av IR⁴¹. Det finns många rapporter om utvecklingen av bildanalyslösningar för användning i automatiserad^{poängsättning 42,43,44,45,46}. I detta protokoll används en automatiserad, hög genomströmning fluorescerande mikroskopi plattform för att analysera γ-H2AX högborgar i perifera blod lymfocyter. Användningen av ett automatiskt poängsystem undviker både interlaboratorium och inter-observer scoring bias, medan det fortfarande tillåter tillräcklig känslighet för att upptäcka doser under 1 Gy⁴⁷. Den främsta fördelen med detta system jämfört med gratis programvara med öppen källkod för foci-poängsättning är det faktum att hela processen från skanning av bilder till att fånga och poängsättas automatiseras. Begreppet användarde definierbara och lagringsbara klassificerare garanterar reproducerbarhet, vilket tillför en opartisk grad av kvalitet till resultaten. Därför illustrerar detta arbete hur γ-H2AX foci-resultat kan erhållas med hjälp av en automatiserad mikroskopisk skanning och poängsättningsmetod som kan användas när blodprover från potentiellt överexponerade individer tas emot av radiobiologiska laboratorier för biologiska dosimetriändamål.

Protocol

Denna studie godkändes av Biomedical Research Ethics Committee vid University of Western Cape Ethics Committee – Code BM18/6/12. 1. Utarbetande av lösningar48 Cellfixeringslösning (3% PFA i PBS) Använd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) och arbeta i en rökhuv, tillsätt 20 g paraformaldehyd till 200 ml destillerad H2O. Värm blandningen till 60 °C för att underlätta upplösningen. När PFA är upplöst, tillsätt 40 droppar 5 N NaOH försiktigt under 30 minuter och svalna till rumstemperatur. Justera till pH 7 med 1 M HCl och gör upp till en slutlig volym på 250 ml med destillerad H2O (alikvoter kan lagras vid -20 °C i 1 år). Tillsätt 25 ml från denna lösning till 41,7 mL PBS för att ha råd med en 3% PFA-lösning. 1% BSA-lösning (Bovine Serum Albumin): Tillsätt 10 g BSA till 1000 ml PBS och blanda tills den är upplöst. Förvara vid 4 °C tills den används (max 72 timmar). Triton-X Lösning i en koncentration av 1:500: Tillsätt 1 μL Triton-X till 500 μL PBS, förvara vid 4 °C tills den används (högst 24 timmar). Antikroppslösningar Primär antikropp – Anti-γ-H2AX i koncentration av 1:500: Tillsätt 1 μL anti-γ-H2AX till 500 μL 1% BSA-lösning, förvara vid 4 °C tills den används (högst 24 timmar). Sekundär antikropp – DAM-TRITC i koncentration av 1:1000: Tillsätt 1 μL DAM-TRITC till 1000 μL 1% BSA-lösning, förvara vid 4 °C tills den används (högst 24 timmar). Komplett Roswell Park Memorial Institute (cRPMI) Media Tillsätt filtrerat fetalt bovinserum (FBS) och Penicillin-Streptomycin till RPMI 1640-media i en steril flaska för att ge en slutlig koncentration på 10% FBS och 1% Penicillin-Streptomycin. 2. Beredning av prover OBS: För detta protokoll samlas perifera helblodsprover in genom venipuncture i litium-heparin insamlingsrör från friska vuxna frivilliga (med informerat samtycke – BM18/6/12 Biomedical Research Ethics Committee vid University of Western Cape Ethics Committee). Innan du börjar, se till att blodet och densitetsmediet på 1,077 g/ml acklimatiserats till rumstemperatur. Späd det perifera helblodet i en 1:1-volym med PBS i ett förberett biosäkerhetsskåp och lägg försiktigt det utspädda blodet på samma volym som två volymer medium med en densitet på 1,077 g/ml. Det är viktigt att gradvis skikta blodet på densitetsmediet genom att hålla röret lutat vid 45°, vilket säkerställer att blodet och densitetsmediet inte blandas. Överför försiktigt suspensionen till en centrifug och snurra vid 900 x g i 20 minuter. Därefter pipetterar du det “grumliga” skiktet endast till ett nytt sterilt koniskt rör och fyll röret med PBS och centrifug i 10 minuter vid 1000 x g. Därefter aspirera supernatanten med en pipett, var försiktig med att inte störa pelleten, återanvända PBMC-pelleten försiktigt i 1 ml PBS och fyll röret med PBS. Upprepa ovanstående tvättsteg två gånger till för att komma till totalt tre tvättar. Räkna antalet PBMCs med hjälp av en hemocytometer, medveten om att varje ml perifert blod från en vuxen givare kommer att resultera i ett grovt genomsnitt på 1 – 1,5 x 106 PBMCs49. Efter räkningen spädde DU UT PBMC-pelleten till en koncentration av 8 x 105 lymfocyter i 1 ml cRPMI. Tillsätt sedan cirka 2 x 106 PBMCs eller 2,5 ml från den isolerade PBMC-lösningen i ett sterilt koniskt rör för bestrålning. 3. Provbestrålningar VARNING: Hantera strålningsenheten enligt strålskyddsriktlinjerna och använd alltid en fysisk dosimeter. Se till att det bestrålningssystem som används kalibreras och ställ in så att rätt förväntade doser uppnås. Bestråla PBMCs i rumstemperatur med hjälp av en 60Co-källa. Kalibrera (TRS-398 protokoll) med en Farmer 117 kammare för vilken en kammarkalibreringsfaktor erhålls från National Metrology Institute of South Africa (NMISA)50. För denna analys placerar du koniska rören mellan ett 5 mm akrylark (används för stråleinmatning) och 50 mm backscattermaterial med den nuvarande dosen 60Co-källdosen på 0,57 Gy/min för en 300 mm × 300 mm homogen fältstorlek vid 750 mm källavstånd till ytavstånd. Bestråla pbbc med graderade doser på 0,125, 0,500, 1 000, 1 500 och 2 000 Gy och behåll de sken bestrålade kontrollproverna i kontrollrummet och endast få exponering för strålning i omgivningen. Inkubera de bestrålade proverna i 1 timme vid 37 °C i en fuktad inkubator på 5 % CO2 för att nå det maximala antalet γ-H2AX-högborgar.OBS: Inkubationstiden kan ändras enligt experimentell design. 4. Glidförberedelse OBS: Se bild 1 för bildinställning. Förbered 3 diabilder (tekniska upprepningar) med diabilder belagda med en positivt laddad yta för att förbättra vidhäftning per bestrålningstillstånd (eller per koniskt rör). Placera bilden i klipphållaren, lägg till filterkortet ovanpå det och slutligen tratten. Fäst glidklämmorna och placera i cytocentrifugen. Tillsätt 250 μL av cellupphängningen i tratten (200 000 celler/glid) och snurra i 30 x g i 5 minuter med en cytocentrifuge. Efter cytocentrifugation, ta bort bilden från klämhållaren och använd en hydrofob penna, rita en cirkel runt platsen med cellerna för att behålla den immunfluorescent fläcken på de bundna cellerna under färgningsprocessen. 5. Fixering och immunofluorescens γ-H2AX färgning OBS: Alla lösningar läggs försiktigt direkt på cellområdet som kännetecknas av en hydrofobisk cirkel. Färgningslösningarna doseras något ovanför rutschkanan utan att pipettspetsen kan störa cellerna. Lösningar läggs INTE till i hela bilden. Fixera bilderna i nyberedd 3% PFA i 20 minuter.OBS: Diabilderna kan förvaras i PBS som innehåller 0,5% PFA vid 4 °C i högst 2 dagar innan immunstaining utförs. Tvätta sedan rutschkanorna i en Coplin-burk med PBS i 5 minuter och täck sedan cellerna med 100 μL av den kalla Triton-X-lösningen i 10 minuter för att möjliggöra permeabilisering. Tippa triton-X-lösningen på mjukpapper och tvätta rutschkanorna tre gånger i 1% BSA-lösning i 10 minuter. Detta görs för att förhindra oönskad bakgrund genom att blockera ospecificerad antikroppsbindning. Inkubera diabilder vid rumstemperatur med 100 μL av den 1:500-utspädda primära anti-γ-H2AX-antikroppen i 1 timme i en fuktkammare, lätt att åstadkomma genom att tillsätta vått vävnadspapper vid basen av en rektangulär slidelagringslåda. Tipsa antikroppslösningen på vävnadspapper och utför tre tvättar med 1% BSA-lösning i 10 minuter i en Coplin-burk för att avlägsna obunden primär antikropp och för att förhindra icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen. Inkubera diabilder med 100 μL av den 1:1000 utspädda sekundära DAM-TRITC-antikroppslösningen i 1 timme i fuktkammaren. Tippa av antikroppslösningen på mjukpapper och tvätta bilderna i PBS i 10 minuter tre gånger. Torka slutligen rutschkanorna utanför den hydrofoba cirkeln med mjukt, dammfritt mjukpapper och tillsätt 1-2 droppar DAPI löst i ett vattenhaltigt monteringsmedium och täck försiktigt glidet med en 24 x 50 mm täckglidning, så att det inte finns några fångade luftbubblor och placeras i kylskåpet vid 4 °C över natten. Diabilder kan förvaras vid 4 °C i högst 2 veckor före skanning. 6. Automatiserad skanning och poängsättning av bilder OBS: Skanningssystemet måste ha ett fluorescerande mikroskop, en högupplöst CCD-kamera (laddad kopplad enhet) ansluten till en ramgripare för digitalisering i realtid av videobilder, ett skanningssteg, styrkula för manuella rörelser, 3D-mus, snabb PC och bildskärm och hårddisk för arkivering(bild 2). Inställningar för klassificerareOBS: Klassificeraren är en uppsättning parametrar som definierar hur systemet identifierar celler. Det är resultatet av utbildningen baserad på förklassificerade bildfält. En klassificerare är specifik för en mikroskopförstoring, celltyp och laboratorium. Klassificerare kan därför kräva ändringar i följande parametrar för att anpassa dem till de aktuella förhållandena. Vi rekommenderar att du testar inställningarna med en referensbild före utvärdering. Bildförvärv: Använd ett 40x torrt mål för avbildning. För att uppnå jämförbar bildkvalitet i alla celler ställer du in kamerans integrationstid på automatiskt läge. Ställ in den maximala integrationstiden på minst 1 sekund för båda färgkanalerna (kameraökning 4.0). Signalkanalen förvärvas med 10 fokusplan och 14/40 μm mellan planen. Cellval: PBBC inom ett intervall av 20,00 μm2 och 76,00 μm2 detekteras. Ställ in det maximala konkavitetsdjupet på 0,05 och det maximala bildförhållandet till 1,4. Ange det relativa tröskelvärdet för grå nivå till 20 %. Cellbehandling: Bearbeta DAPI-räknarkanalen med en histogram maximal algoritm för att minska bakgrunden. Signalkanalen bearbetas med ett TopHat-filter (styrka 7, utjämningsfaktor 0) för att minska bakgrunden och förbättra signalerna. Signalräkning: Räkna högar med hjälp av enhetens objekträkningsfunktion. För att undvika falskt positiv utvärdering av återstående bakgrundssignaler räknas endast de signaler som visar minst 30% av intensiteten jämfört med det ljusaste objektet i cellen. Sätt i/Placera bilderna på den automatiserade skanningsplattformen eller glidsteget, efter att försiktigt ha rengjorts med 70% etanol, för att avlägsna damm. Bildinställningar – Öppna dialogmeny för bildinställningar (bild 3) Välj rätt datasökväg, det anger var bildfilerna som är resultatet av sökningen lagras. Ge bilden ett namn, varje bild måste ha fått ett unikt namn. Om en serie bilder anges i form av en uppräknad lista kan “?” användas som jokertecken för bildnumret. Välj lämplig klassificerare enligt beskrivningen i avsnitt 1.1 – 1.4 (bild 4). Markera sökfönstret och välj Fördefinierad om en sökfönsterdefinition som matchar cytocentrifugecellcirkeln finns, markera respektive definition i kolumnen Storlek eller välj Manuell om det inte finns någon fördefinierad sökfönsterdefinition tillgänglig. I det här fallet behöver kolumnen Storlek inte anges. Välj Maximalt antal celler och lägg till det maximala antalet celler som krävs för att skannas. Sökningen avslutas även om det valda sökfönstret ännu inte har skannats helt så snart antalet maxceller har uppnåtts. För biodosimmetriapplikationer är automatiserad poängsättning av 1000 celler per bild tillräcklig, med tanke på att 3 diabilder per blodprov bereds. Klicka på OK för att bekräfta inställningarna. Installationsprogram för bildsökning Klicka på knappen Sök i sidofältet. Om inställningen Manuellt sökfönster har valts i bildinställning öppnas en dialog som gör det möjligt att bestämning av skanningsområdet(bild 5). Genom att använda 10x-målet markerar du det rektangulära sökområdet på bilden interaktivt genom att fästa två hörn av sökfältet med vänster musklick. Detta kan bekräftas med OK-knappen. Om sökfönstret refererar till ett fördefinierat sökfönster utelämnas det här steget. Användaren uppmanas att justera en fokusstartposition. Ett referensobjekt väljs sedan automatiskt, programvaran uppmanar användaren att fokusera och centrera en referenskärna (med 40x-målet) för varje bild och bekräfta inställningarna med OK. Systemet flyttas automatiskt till alla bilder sekventiellt. Om det behövs justerar du Live Image Setup – Integration Time för det här steget ( bild5). Kontrollera alla mikroskopinställningar och bekräfta systemtolken med OK. Systemet startar den automatiska fokuserings- och skanningsproceduren. När skanningen är klar sparas data på datorn för analyser. Skanningssystemet stängs automatiskt av när skanningen är klar.OBS: Se till att mikroskoprörets spak är i ett läge som avleder allt ljus till kameran. Sökslut, sökningen avslutas om hela sökningen har genomsökts, om det maximala antalet celler har uppnåtts eller om sökningen har avbrutits. BildanalysOBS: Den slutförda skanningen finns representerad i figur 6. När genomsökningen är klar klickar du på knappen Galleri i sidofältet. Granska galleriet, som består av små bilder av identifierade celler. I det här fönstret (bild 7) anger du om de celler som lagras i galleriet enligt ett kriterium som ska väljas från en rullgardinsmeny. Celler visas vanligtvis i den ordning de har upptäckts. Klicka på Kvalitets histogram/funktionsvärde diagram (bild 8) för att ge fördelningen av kvalitetsmåttet för de upptäckta cellerna, liksom medel, och standardavvikelsen för foci poäng.

Representative Results

För detta protokoll isolerades humana perifera blod mononukleära celler (PMBCs) från helblod av fyra friska vuxna frivilliga och utsattes för stråldoser av 0,125, 0,250, 0,500, 1.000 och 2.000 Gy. Därefter inkuberades proverna i 1 timme vid 37 °C i en fuktad 5% CO2 inkubator. Efter fixering och immunofluorescensfärgning skannas och poängsättas bilderna automatiskt. Figurerna 6,7 och 8 ger en representation av vad programvaran matar ut till användaren. Ett analysfönster visas när genomsökningen är klar, vilket ger en översikt över de foci-poäng som har poängsatts. Galleriet ger alla foci-poäng med en interaktiv meny som kan ta bort avvikande värden och slutligen ges ett histogram med en detaljerad datasammanfattning. Γ-H2AX-fociutbyte efter exponering för γ-strålar presenteras i figur 9. Det fanns en gradvis ökning av antalet γ H2AX-högborgar med ökande dos. Detta diagram illustrerar inte bara dosberoendet och känsligheten hos analysen, utan passformen kan också användas för att utföra en dosuppskattning när ett prov tas från en individ som har utsatts för en okänd dos. Det är viktigt att notera att man inte kommer att ha sham-bestrålning kontroll eller bakgrund foci nivåer för denna individ. Därför innehåller figur 9 0 Gy-värdet för de sham-bestrålade kontrollproverna, som var 0,57 ± 0,23 Gy för de fyra vuxna donatorerna i denna studie. Bild 1: Beredning av diabilder förcytocentrifugering. Placera bilden i klipphållaren, lägg till filterkortet ovanpå det och slutligen tratten. Fäst glidklämmorna och placera i cytocentrifugen. Efter cytocentrifugation, ta bort bilden från klipphållaren och rita en cirkel runt platsen med cellerna med hjälp av en hydrofob penna. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 2: Den automatiserade skanningsplattformen som användes i detta protokoll, innehållande en automatiserad skanner fäst vid ett fluorescerande mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Bild 3: Meny för bildinställning. Öppna dialogen genom att klicka på inställningsknappen i sidofältet. Välj eller ange målkatalogen för resultatfilerna Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Bild 4: Menyn för installationsprogrammet för klassificeraren. Kontrollera att de valda klassificerarinställningarna matchar provets aktuella celltyp, förberedelseförhållanden och färgningsmönster. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 5: Installationsmenyn för manuellt sökfönster. Fönstret valdes i bildinställningarna. En dialog kommer att inledas som gör det möjligt att fastställa skanningsområdet. Genom att använda 10x-målet väljs det rektangulära sökområdet i bilden interaktivt genom att fästa två hörn av sökfältet med vänster musklick. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 6: Analysfönster, när skanningen är klar visar analysfönstret resultaten av skanningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Bild 7: Gallerivy för den markerade bilden. Fliken Galleri finns i sidofältet. Bildgalleriet består av små bilder av de celler som detekteras, som visas som en kombinerad DAPI-TRITC-bild. I det nedre vänstra och högra hörnet av varje bild visas det direkta antalet foci och de korrigerade foci-räkningarna. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Bild 8: Histogrambilder för den markerade bilden. Det här fönstret öppnas genom att högerklicka på histogrammet. Genom att klicka på histogrammet ger flikbladet histogram en datasammanfattning som listar medelvärdet, standardavvikelsen, variationskoefficienten, minimi-, maximi- och medianvärdena för de analyserade cellerna. Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 9: Antalet γ H2AX-högborgar som dosfunktion för lymfocyter som exponeras för 60Co-γ-strålar. Felstaplarna är standardavvikelserna som representerar den interindividuala variationen mellan donatorerna. Data representerar det genomsnittliga antalet γ-H2AX-foci ± standardavvikelse för fyra friska frivilliga. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Discussion

Detta protokoll beskriver en stegvis förfarande för automatiserad fluorescerande mikroskopi-baserade poängsättning av γ-H2AX foci assay. Det illustrerar nyttan av foci-analysen som en tidseffektiv metod för att analysera antalet strålningsinducerade DNA DSB i perifera blodlymfocyter för att utföra en biologisk dosbedömning i ett strålningsscenario där individer kan utsättas för okända nivåer av IR.

I detta specifika protokoll bestrålades PBMCs in vitro för att efterlikna en in vivo strålning exponering. När bestrålningen och inkubationstiden på en timme är klar görs bilder med hjälp av en cytocentrifuge för att skapa en koncentrationspunkt av celler på bilden. Användningen av en cytocentrifuge är avgörande för att uppnå standardiserade villkor för automatiserad poängsättning. När den är klar används en hydrofob penna för att göra en cirkel runt cellerna, för att minska slöseri med reagenser genom att låta användaren lokalisera färgningsreagenserna. Denna typ av penna kan användas i olika immunstaining tekniker såsom på paraffin sektioner, frysta sektioner och cytologi preparat. Dessutom är det viktigt att välja en hydrofob penna som är kompatibel med enzym- och fluorescerande detekteringssystem. Efter glid beredning, fixering och immunofluorescence γ-H2AX färgning inträffade. I det här protokollet fixeras cellerna med 3% PFA i en PBS-lösning i 20 minuter. För att immunostaining ska lyckas är det viktigt att cellernas morfologi behålls och att de antigena platserna är tillgängliga för de detektionsreagenser som används. PFA är ett relativt skonsamt medel för fixering och stabiliserar celler samtidigt som^{proteinstrukturerna 51}bevaras. Optimeringsexperiment med högre PFA-koncentrationer och längre fixeringstider resulterade i en negativ inverkan på glidkvaliteten, men ytterligare lagring (över natten) i 0,5% PFA upp till 24 timmar gav bra resultat.

Den primära monoklonala antikroppen 2F3 som används i detta protokoll reagerar på histonvarianten H2AX när den fosforyleras vid Serine 139 efter DNA DSB-induktion. Antikroppen kan binda till fosforylerade rester utan korsreaktivitet med andra fosforylerade histoner⁵². Eftersom detta är en primär mus monoklonal antikropp, valdes en sekundär antikropp mot värdarten för den primära antikroppen medan den höjdes i en alternativ värd, nämligen åsne-anti-mus (DAM)-TRITC. Medan immunofluorescent färgning är baserad på specifik antikropp-epitopbindning, kan flera intermolekylära krafter också resultera i icke-specifika bakgrundsfärgning. För att minska icke-specifik bindning är det viktigt att använda ett blockerande reagens i immunofluorescent färgningsprotokoll^53; Vi använde en BSA-lösning. Dessutom bör tillräckligt med tid avsättas för detta blockerande steg genom att lämna bilderna i lösningen i minst 20 minuter före primär och sekundär antikroppsfärgning. Dessutom bör BSA-lösningen också användas som spädning för de primära och sekundära antikropparna. Beroende på den anti-γ-H2AX och den sekundära antikroppen som används för färgning bör man överväga att testa olika antikroppsutspädningar för att bestämma den optimala koncentrationen. För mer exakt poängsättning kan en dubbel färgning utföras genom att lägga till ytterligare DNA DSB reparation protein antikroppar.

En stor nackdel med denna typ av analys är behovet av att ta blodprover så snart som möjligt efter exponering, eftersom det maximala antalet högborgar är känt för att minska tillbaka till normala nivåer inom 48 timmar efter bestrålning. När tidpunkten för strålningsolyckan och efterföljande blodprov är känd kan det därför vara användbart att arbeta med olika kalibreringskurvor som har fastställts vid olika tidpunkter efter in vitro-bestrålning (t.ex. 4, 8, 12 och 24 timmar). Men som redan nämnts i inledningen av manuskriptet ligger styrkan hos γ-H2AX foci assay i initiala, snabba triageändamål och det bör användas för att prioritera mer tidskrävande cytogenetisk biologisk dosimetri. Ett kombinerat scenario där flera biodosimmetribiomarkörer används parallellt kommer att generera den mest tillförlitliga dosuppskattningen och olika biodosimmetrilaboratorier över hela världen har gått samman för att inrätta rikstäckande nätverk som kan aktiveras och användas för att möjliggöra flera parallella biodosimmetribedömningar av laboratorier med olika expertis^37,54,55 . Dessutom pågår utvecklingen för supersnabb analys, till exempel ett mobilt laboratorium på eller i närheten av olycksplatsen⁵⁶. Nya, lovande biodosimmetrimetoder utvecklas ständigt, vilket förhoppningsvis kommer att resultera i ännu snabbare och mer tillförlitlig genomströmning i framtiden⁵⁷.

För det automatiserade bildanalyssystemet infogas eller placeras bilder på den automatiserade skanningsplattformen eller bildstadiet. Därefter namnge och spara bildinformationen i lämplig mapp på den bifogade datorn. För det här experimentet baseras automatisk kärnor och foci-identifiering på respektive klassificerarinställningar. När du skapar en klassificerare ser du till att de valda klassificerarinställningarna matchar den aktuella celltypen, förberedelseförhållandena och immunofluorescentfärgningen av provet. Lämpliga fluorescerande kanaler som matchar excitationsspektrumet hos de primära och sekundära antikropparna ställs in i klassificeraren. Klassificeraren gör det möjligt att ställa in ytterligare poängparametrar vid behov (t.ex. kärnstorlek, fluorescerande intensitet enligt beskrivningen i avsnitt 6.1). Om två eller flera DNA-reparationsproteiner (t.ex. γ-H2AX och 53BP1) kombineras i ett experiment, kan systemet också upptäcka samlokaliseringar av signaler. Först hämtar systemet DAPI-bilder, tillämpar bildbehandling och identifierar kärnor med hjälp av morfologiska kriterier som anges i klassificeraren. TRITC-signalerna förvärvas med hjälp av 10 z-staplar med en stegstorlek på 0,35 mm mellan brännplan⁴⁷. Klassificeraren använde direkt foci count, där antalet distinkta TRITC-signaler i kärnan poängsatts. Här är det viktigt att ta hänsyn till att med ökande stråldos tenderar focisignaler att smälta samman till större objekt, vilket resulterar i en underskattning av det faktiska foci-talet om objekt räknas direkt. Det krävdes inte för analysen som beskrivs här, men ett ytterligare steg med Korrigerad foci count kan implementeras för att lösa detta problem. Det senare gör det möjligt för systemet att erhålla storleken på de detekterade signalerna och väger dem i enlighet därmed. Med hjälp av båda räknemetoderna kan ge en mer realistisk uppskattning av det faktiska antalet högborgar vid högre doser.

För att påbörja automatisk skanning bestäms skanningsområdet med hjälp av mikroskopets 10x-mål för att skapa ett rektangulärt sökområde genom att fixera två hörn av sökfältet med vänster musklick (Bild 5), följt av att fokusera startpositionen. Referensobjektet väljs automatiskt och programmet uppmanar användaren att fokusera och centrera en referenskärna (med 40x-målet) för varje bild. När sökningen har påbörjats flyttas systemet till mitten av sökfönstret i den första markerade bilden och begär att centrera och fokusera referensobjektet. Det här objektet kommer senare att användas som en positionsreferens för att korrigera eventuella skift i cellens positioner. Referensfältets andra syfte är automatisk ljusjustering, i överfört ljusläge justeras ljuset tills den optimala ljusnivån uppnås. I fluorescensläge är ljusnivån fast, men CCD-kamerans integrationstid kan ökas tills den önskade signalen mäts. För att möjliggöra en korrekt ljusjustering bör referensen innehålla objekt med typisk färgning. Det är viktigt att inte använda ett fält som har artefakter med mycket hög färgningsintensitet. Efter ljusjusteringen startar systemet rutnätets autofokus vid rutnätspositionen närmast referensfältet. Den fortsätter att fokusera fälten på ett vanligt rutnät och rör sig i en meander mot framsidan och baksidan av sökfönstret. Skanningen börjar när rutnätets autofokus är klar. Scenen flyttas i ett meandermönster fält efter fält för att samla in data. När en cell upptäcks lagras och visas dess position och galleribild på skärmen och antalet celler uppdateras. Om ett mikroskop-, steg- eller matarfel inträffar avbryts sökningen automatiskt. Det enda steget där det finns en manuell åtgärd från operatören är under bildskanningsuppsättningen. Detta är också den punkt där en snabb kvalitetskontrollkontroll äger rum (luftbubblor, låga cellnummer, blekning av fluorescerande signalfärgningsföremål) och där det kan beslutas att avbryta skanningen av en bild av sämre kvalitet. En sökning avslutas om hela bilden har genomsökts, om det maximala antalet celler har uppnåtts eller om sökningen har avbrutits. När skanningen är klar presenteras data som framgår av Bild 6. Om du vill visa skannade celler öppnas gallerifönstret och varje cell kan visas (Figur 7). Detta är en annan punkt där operatören kan utföra en kvalitetskontroll genom att kontrollera fokus för galleribilderna och det totala antalet celler som har poängsatts. Om för många celler är ur fokus eller för små celler upptäcktes av systemet för att göra en realistisk dosuppskattning (t.ex. 100 celler istället för de avsedda 1000 cellerna), bör beslutet fattas att utesluta bilden och den automatiska poängen från den slutliga utvärderingen. Alla data sammanfattas i histogram (Bild 8), tillsammans med information om fördelningen, medlen och standardavvikelsen för foci som poängsatts för varje cell. Histogrammen kan också användas för att välja och visa underpopulationer av kärnor baserat på de automatiserade resultaten för granskning. Statistiska analyser av resultaten utförs efter att fördelningen, medelvärdet, och standardavvikelsen för antalet foci per cell har registrerats manuellt. Diagrammet kan användas som kalibreringskurva för att göra en dosuppskattning av ett biodosimmetriprov. Detta kan göras med hjälp av ekvationen av trendlinjen för att göra en ungefärlig uppskattning av den mottagna dosen. Dessutom Bild 9 visar att den automatiska skanningen är tillräckligt känslig för att detektera foci inducerad vid låga doser. Dessutom visar resultaten en tydlig linjär ökning av antalet högborgar per cell med dos. Det bör noteras att resultaten endast är representativa för den använda klassificeraren, resultaten kommer att skilja sig åt för olika klassificerarparametrar. Vid en biodosimmetrianalys är det därför viktigt att samma klassificerare och glidpreparat används för biodosimmetriproverna som de som har använts för att fastställa kalibreringskurvan som används för att utföra dosuppskattningen. Även om det låg utanför denna studie är det viktigt att notera att γ-H2AX foci assay också kan användas för att bestämma partiella kroppsbestrålningar. De flesta oavsiktliga strålningsexponeringar är inhomogena eller partiella kroppsexponeringar, där endast en lokaliserad del av kroppen fick en hög dosexponering. Flera studier visade att det är möjligt att använda γ- H2AX foci-analys för att uppskatta den del av kroppen som har bestrålats och dosen till den bestrålade fraktionen⁴². När en helkroppsbestrålning äger rum kommer det att ske slumpmässig induktion av DNA DSB i alla celler och man kan förvänta sig att hitta en Poisson-fördelning. Liknar cytogentiska metoder där induktion av kromosomal avvikelser tenderar att vara överdisperserad i perifera blodlymfocyter där det finns ett högt överflöd av celler med flera avvikelser och celler med normala metafaser, dispersionsanalys av γ-H2AX-högborgar med hjälp av en förorenad Poisson-metod som föreslås över spridda foci-distributioner⁵⁸. Det senare bekräftades också i in vivo experiment med minipigs och en rhesus makaker⁵⁹.

Materials

Bovine serum albumin – BSA	Merck	A3059
Coplin Jar	Sigma	S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm)	Lasec	Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL)	WhiteSci	607101
Cytospin	Healthcare Technologies	JC370-12-L
Cytospin Clips	Healthcare Technologies	JC302
Cytospin filter cards	Healthcare Technologies	JC307
Cytospin Funnels	Healthcare Technologies	JC372
DAM-TRITC	Invitrogen	A16022
DAPI-Fluroshield	Sigma/Merck	F6057
Ethanol	Kimix	ETD901
Filter tips	WhiteSci	200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl	Merck
Histopaque	Sigma/Merck	10771
lithium–heparin collection tubes	The Scientific Group	367526
MetaSystems – Metafer	Metasystems	Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH	Merck	221465
NovoPen	Leica Biosystems	NCL-PEN
Paraformaldehyde	Sigma/Merck	158127
Phosphate-buffered saline Tablets	Separations	SH30028,02
Pipettes	WhiteSci	P11037 and P1033	X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613402 / 100 μg
RPMI medium	WhiteSci	BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Sigma/Merck	T-9284
Tubes (15ml)	WhiteSci	601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped	SMM Technologies	3800200E