Descriviamo un metodo per generare retinoblastoma umano (RB) introducendo mutazioni bialleliche RB1 nelle cellule staminali embrionali umane (hESC). Le linee cellulari RB potrebbero anche essere coltivate con successo usando l'RB isolato in un piatto.
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Articolo metodologico
Ricostruire il retinoblastoma umano in vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
La RB umana è un cancro pediatrico, che è letale se non viene somministrato alcun trattamento. Poiché RB proviene da precursori dei coni, che è relativamente raro nei modelli di roditori, nel frattempo per quanto riguarda le differenze interspecie tra esseri umani e roditori, un modello di malattia derivato dagli esseri umani è più vantaggioso per scoprire i meccanismi della RB umana e cercare gli obiettivi della terapia. Qui, il protocollo descrive la generazione di due linee hESC geneticamente modificate con una mutazione puntiforme RB1 biallelica (RB1 Mut/Mut) e una mutazione knockout RB1 (RB1-/-), rispettivamente. Durante il processo di sviluppo della retina, si osserva la formazione di RB. Le linee cellulari RB sono anche stabilite segregando dagli organoidi RB. Complessivamente, differenziando le linee hESC geneticamente modificate negli organoidi retinici utilizzando un protocollo di differenziazione combinato 2D e 3D, abbiamo ricostruito con successo il RB umano in un piatto e identificato la sua origine cono-precursore. Fornirebbe un utile modello di malattia per osservare la genesi, la proliferazione e la crescita del retinoblastoma, nonché per sviluppare ulteriormente nuovi agenti terapeutici.
Introduzione
Il retinoblastoma umano (RB) è un tumore raro e fatale derivato dai precursori dei coni retinici 1,2,3, è il tipo più comune di neoplasia intraoculare nell'infanzia4. L'inattivazione omozigote del gene RB1 è la lesione genetica iniziale in RB5. Tuttavia, i topi con mutazioni RB1 non riescono a formare il tumore retinico2. Sebbene i tumori del topo possano essere generati con la combinazione di mutazioni di Rb1 e altre modificazioni genetiche, mancano ancora delle caratteristiche....
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Protocollo
Questo studio è approvato dal Comitato etico istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. Le H9 hESC sono ottenute dal WiCell Research Institute.
1. Generazione di hESC RB1 mutato
- Vettore di targeting CRISPR/Cas9 per il knockout (KO) di RB1.
- Progetta una coppia di sgRNA. Per l'ablazione di RB1, colpire il primo esone di questo gene. La sequenza di primer in avanti è CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, e la sequenza di primer inversa è AAACCCGAAAAACGGCCCCCCCCGC.
NOTA: per la mutazione RB1 specifica, è necessario anche un modello riparato. In questo protocollo, la li....
- Progetta una coppia di sgRNA. Per l'ablazione di RB1, colpire il primo esone di questo gene. La sequenza di primer in avanti è CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, e la sequenza di primer inversa è AAACCCGAAAAACGGCCCCCCCCGC.
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Risultati
La procedura di generazione di RB è spiegata nella Figura 1, che combina la coltura aderente e fluttuante. È stato possibile raccogliere il RB umano da RB1-KO hESC e ottenere la linea cellulare RB isolando gli organoidi RB.
Qui, il protocollo fornisce i dettagli della differenziazione in diverse fasi (Figura 2). Nei primi 3 giorni si formano sfere cave che si attaccano alla superficie della coltura e poi si espandono (
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Discussione
Il retinoblastoma umano (RB) è causato dall'inattivazione di RB1 e dalla disfunzione della proteina Rb. In questo protocollo, l'hESC RB1-KO è il passo fondamentale per la generazione di RB in un piatto. Mentre anche con RB1-/- hESC, è possibile che non vi sia formazione di RB a causa dei metodi di differenziazione organoide retinica10. In questo protocollo, il trasferimento dalla coltura aderente alla coltura galleggiante è essenziale nel processo di differenz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non sono a conoscenza di affiliazioni, appartenenze, finanziamenti o partecipazioni finanziarie che potrebbero influenzare l'obiettività di questo studio.
Ringraziamenti
Ringraziamo il team 502 per tutto l'aiuto. Questo lavoro è in parte supportato dalla Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) e dal National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoetanolo | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Anticorpo |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Anticorpo |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Anticorpo |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 13198 | Anticorpo |
| BbsI | NEB | R3539S | Enzimi di restrizione |
| Dispasi (1U/mL) | Tecnologie Stemcell | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Siero fetale bovino (FBS), qualificato per l'industria biologica delle cellule staminali embrionali umane | 04-002-1A | ||
| Glutammina | Gibco | 35050-061 | |
| Miscela di nutrienti F-12 del prosciutto (prosciutti F12) | Gibco | 11765-054 | |
| Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100X) | Sigma | M7145 | |
| Medium neurobasale | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Cellula primaria 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Kit di nucleofeczione |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Operazione del gene | della puromicina | ISY1130- 0025MG | |
| Kit di purificazione per PCR | QIAquick QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiTerreno di coltura PSC/hESC | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiTerreno di coltura PSC/hESC in 1.2.1 |
| Matrice di membrana basale ridotta con fattore di crescita | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Enzima di dissociazione cellulare | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplemento A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Integratore (100X), liquido, supplemet in medum I |
| Supplemento B Life | Technologies | 17105-041 | B-27 Integratore (50X), liquido, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polinucleotide chinasi | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurina | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
Riferimenti
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al.
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Ristampe e permessi
