Qui viene presentato un protocollo per l'impianto di una finestra cranica cronica per l'imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa.
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Articolo metodologico
Impianto di una finestra cranica per l'imaging ripetuto in vivo in topi svegli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per comprendere appieno la fisiologia cellulare dei neuroni e della glia negli animali che si comportano, è necessario visualizzare la loro morfologia e registrare la loro attività in vivo nei topi che si comportano. Questo documento descrive un metodo per l'impianto di una finestra cranica cronica per consentire l'imaging longitudinale delle cellule cerebrali in topi svegli e trattenuti dalla testa. In combinazione con strategie genetiche e iniezioni virali, è possibile etichettare cellule e regioni di interesse specifiche con marcatori strutturali o fisiologici. Questo protocollo dimostra come combinare iniezioni virali per etichettare i neuroni nelle vicinanze degli astrociti che esprimono GCaMP6 nella corteccia per l'imaging simultaneo di entrambe le cellule attraverso una finestra cranica. L'imaging multifotonico delle stesse cellule può essere eseguito per giorni, settimane o mesi in animali svegli e che si comportano. Questo approccio fornisce ai ricercatori un metodo per visualizzare le dinamiche cellulari in tempo reale e può essere applicato per rispondere a una serie di domande nelle neuroscienze.
Introduzione
La capacità di eseguire la microscopia a fluorescenza multifotone in vivo nella corteccia dei topi è fondamentale per lo studio della segnalazione e della struttura cellulare 1,2,3,4,5,6,7,8,9, della patologia della malattia 10,11 e dello sviluppo cellulare12,13
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida approvate dalla IACUC presso l'Università del Nebraska Medical Center.
1. Prima dell'intervento chirurgico
- Preparare le pipette per le iniezioni virali. Tirare i capillari di vetro borosilicato usando un estrattore di pipette e smussare la pipetta con un angolo di 20 °. Sterilizzare le pipette durante la notte.
- Preparare pezzi freschi di schiuma gel sterile tagliandoli in piccoli quadrati. Immergere la schiuma di gel in un tubo di microfuga sterile contenente 0,5 ml di soluzione salina. Immergere la schiuma gel in soluzione salina pe....
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Risultati
La qualità della finestra cranica può essere valutata da quanto appaiono nitide le strutture neuronali. In una buona finestra, le spine dendritiche sono chiaramente visibili (Figura 1). Con i dati strutturali e posizionali memorizzati, lo stesso animale può essere ripreso ripetutamente per giorni, settimane o mesi per esaminare le stesse cellule (Figura 1). Le immagini nella Figura 1 sono state ottenute dalla regione dell'arto anter.......
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Discussione
Qui, abbiamo presentato un protocollo per l'impianto di finestre craniche croniche per l'imaging in vivo di astrociti corticali e neuroni in topi svegli e trattenuti dalla testa su una gabbia domestica sollevata dall'aria. Sono stati forniti esempi specifici dell'applicazione della finestra cranica per l'imaging di astrociti che esprimono GECI e strutture sinaptiche neuronali. Con l'uso della microscopia multifotonica, la dinamica di segnalazione del calcio astrocitico e la dinamica sinaptica strutturale possono.......
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 15o Lama appuntita | Surgistar | 6500 | Strumenti chirurgici |
| 19 G Aghi | BD | 305186 | Fornitura chirurgica |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Vettore virale |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Vettore virale |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagente |
| Tamponi per la preparazione dell'alcol | Scientific | Covidien 5750 | Fornitura chirurgica |
| Beveler | Narishige | Attrezzatura | |
| vetro borosilicato | World Precision Instruments | TW100F-4 | Fornitura chirurgica |
| Frese in metallo duro | SS White Dental | 14717 | Strumenti chirurgici |
| Carprofene (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC.Drug | ||
| Aria compressa | Fisher Scientific | 23-022-523 | Forniture chirurgiche |
| Applicatori con punta in cotone | Puritan | 836-WC NO BINDER | Copertura per forniture chirurgiche |
| in vetro, spessore n. 1, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Forniture per chirurgia |
| Trapano dentale | Aseptico | Attrezzatura | |
| Desametasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Microscopio | |
| per dissezione di | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (liquido per cemento dentale) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagente |
| Duralay Powder (polvere di cemento dentale) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagente |
| Enrofloxacina, 2,27% | Bayer | Drug | |
| Unguento per gli occhi | Dechra | 17033-211-38 | Fornitura chirurgica |
| Illuminatore ad alta intensità Fiber Lite | Dolan-Jenner Industries | ||
| Attrezzature Pinze (grandi) | World Precision Instruments | 14099 | Strumenti chirurgici |
| Pinze ( Strumenti | precisione | 501764 | strumenti chirurgici |
| GCaMP6f B6; 129S-GT(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | Il laboratorio Jackson Codice | prodotto: 024105 | Linea di topi |
| Germinatore | Fisher Scientific Equipment | ||
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | Il laboratorio Jackson Codice | prodotto: 012586 | Linea di topi |
| Piastra | di testa Neurotar | Modello 1, Modello 3 | Fornitura per |
| chirurgia Pinze emostatiche | World Precision Instruments | 501705 | Supporto per strumenti chirurgici |
| 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | World 501247 | Surgical Tools |
| Holder per lame per bisturi | Precision Instruments | 500236 | Strumenti |
| Tamponi per la preparazione dello iodio | Avantor | 15648-926 | Fornitura chirurgica |
| Isoflurano | Piramal | Fornitura | |
| per chirurgia Sistema da tavolo in isoflurano con scatola di induzione | Attrezzatura Harvard Attrezzatura | ||
| Vaporizzatore di isoflurano | Attrezzatura SurgiVet | ||
| Krazy | Colla Ufficio Deposito | KG517 | Reagente |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | adesivo istantaneo a polimerizzazione rapida |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cianoacrilato gel adesivo |
| Estrattore per micropipette Sutter | Instruments Attrezzatura | ||
| microscopio | |||
| Azoto | Matheson | NI M200 | Gas |
| Ossigeno | Matheson | OX M250 | |
| Gas Picospritzer | Parker | sistema di erogazione per microiniezione intracellulare | |
| Punte per pipette | Rainin | 17014340 | Forniture per |
| chirurgia Tagliacapelli per roditori Attrezzature | Wahl | ||
| Soluzione salina (0,9% cloruro di sodio) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Forniture per |
| chirurgia Lame per bisturi, misura 11 | Integra | 4-111 | Strumenti chirurgici |
| Forbici | World Precision Instruments | Strumenti 503667 | Chirurgia |
| stereotassici | Attrezzature per la stoelting | ||
| Strisce di spugna Sugi (strisce di spugna) | Kettenbach Dental | 31002 | Forniture chirurgiche |
| SURGIFOAM (schiuma gel) | Ethicon | 1972 | Siringa per forniture chirurgiche |
| con ago da 26 G | BD | 309625 | Fornitura chirurgica |
| Tamoxifene | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagente |
| Ti:Zaffiro Laser | Apparecchiature coerenti | ||
| Pipette di trasferimento | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Fornitura |
| chirurgica Coperta d'acqua | Fisher Scientific | Attrezzatura | |
| xilocaina MPF con epinefrina (1:200.000), 10 mg/ mL | Fresenius Kabi USA | Farmaco |
Riferimenti
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. <....
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Ristampe e permessi
