Vi beskriver her etableringen og anvendelsen af en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (benævnt αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) musereporterlinje til omprogrammering af hjerte. Neonatale hjertefibroblaster (NCF’er) isoleret fra musestammen omdannes til inducerede kardiomyocytter (iCMs), hvilket giver mulighed for bekvem og effektiv evaluering af omprogrammeringseffektivitet og funktionel modning af iCMs via calcium (Ca2+) flux.
Hjerte omprogrammering er blevet en potentielt lovende terapi til at reparere et beskadiget hjerte. Ved at indføre flere transskription faktorer, herunder Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblaster kan omprogrammeres til induceret kardiomyocytter (iCMs). Disse iCMs, når de genereres in situ i et infarkt hjerte, integrere elektrisk og mekanisk med det omgivende myokardie, hvilket fører til en reduktion i arstørrelse og en forbedring i hjertefunktionen. På grund af den relativt lave omprogrammering effektivitet, renhed og kvalitet af iCMs, karakterisering af iCMs er fortsat en udfordring. De aktuelt anvendte metoder på dette område, herunder flowcytometri, immunocytokemi og qPCR, fokuserer primært på hjertespecifikt gen- og proteinekspression, men ikke på den funktionelle modning af iCMs. Udløst af handling potentialer, åbningen af spænding-gated calcium kanaler i kardiomyocytter fører til en hurtig tilstrømning af calcium ind i cellen. Derfor er kvantificering af calciumtilstrømningen en lovende metode til at evaluere kardiomyocytfunktion. Her introducerer protokollen en metode til at evaluere iCM-funktionen ved calcium (Ca2+) flux. En αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 musestamme blev etableret ved at krydse Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (kaldet Myh6-Cre nedenfor) med Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (benævnt Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 nedenfor) mus. Neonatale hjertefibroblaster (NCF’er) fra P0-P2 neonatale mus blev isoleret og kultiveret in vitro, og en polycistronisk konstruktion af MGT blev introduceret til NCF’er, hvilket førte til deres omprogrammering til iCMs. Fordi kun med succes omprogrammeret iCMs vil udtrykke GCaMP3 reporter, den funktionelle modning af iMP’er kan visuelt vurderes af Ca2 + flux med fluorescens mikroskopi. Sammenlignet med ikke-omprogrammerede NCF’er viste NCF-iMP’er signifikant calciumtransient flux og spontan sammentrækning, svarende til CMs. Denne protokol beskriver i detaljer musen stamme etablering, isolation og udvælgelse af neonatale mus hjerter, NCF isolation, produktion af retrovirus til hjerte omprogrammering, iCM induktion, evaluering af iCM Ca2 + flux ved hjælp af vores reporter linje, og relaterede statistiske analyse og data præsentation. Det forventes, at de metoder, der er beskrevet her, vil give en værdifuld platform til at vurdere den funktionelle modning af iCMs til hjerte omprogrammeringsundersøgelser.
Myokardieinfarkt (MI) er en alvorlig sygdom på verdensplan. Hjerte-kar-sygdomme (CVD’er) er den hyppigste dødsårsag på verdensplan og tegner sig for ca. 18,6 millioner dødsfald i 20191,2. Den samlede dødelighed af CVD’er er faldet i løbet af det sidste halve århundrede. Denne tendens er imidlertid blevet bremset eller endog vendt i nogle uudviklede lande1, hvilket kræver mere effektive behandlinger af CVD’er. Som en af de fatale manifestationer af CVD, MI tegner sig for omkring halvdelen af alle dødsfald tilskrives CVD’er i USA2. Under iskæmien, med blokering af kranspulsårer og begrænset forsyning af både næringsstoffer og ilt, myokardiet lider alvorlige metaboliske ændringer, forringer den systoliske funktion af kardiomyocytter (DM’er), og fører til CM death3. Talrige tilgange i hjerte-kar-forskning er blevet undersøgt for at reparere hjerteskade og genoprette funktionen af den skadede hjerte4. Direkte hjerte omprogrammering har vist sig som en lovende strategi for at reparere det beskadigede hjerte og genoprette sin funktion5,6. Ved at indføre Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblaster kan omprogrammeres til iCMs in vitro og in vivo, og disse iCMs kan reducere arområdet og forbedre hjertefunktionen7,8.
Selvom omprogrammering af hjertet er en lovende strategi for MI-behandling, er der stadig en række udfordringer. For det første er omprogrammeringseffektivitet, renhed og kvalitet ikke altid så høj som forventet. MGT-tilskyndelse kan kun opnå 8,4 % (cTnT+) eller 24,7 % (αMHC-GFP+) af de samlede CF’er, der skal omprogrammeres til iCMs in vitro7, eller op til 35 % in vivo8, hvilket begrænser anvendelsen heraf. Selv med flere faktorer induceret i systemet, såsom Hand29 eller Akt1/PKB10, er omprogrammeringseffektiviteten stadig næppe tilfredsstillende at blive brugt i kliniske omgivelser. Der er således behov for flere undersøgelser med fokus på at forbedre omprogrammeringseffektiviteten på dette område. For det andet er iMP’ernes elektriske integritet og sammentrækningskarakteristika vigtige for en effektiv forbedring af hjertefunktionen, men disse er udfordrende at evaluere. I øjeblikket er udbredte evalueringsmetoder på området, herunder flowcytometri, immunocytokemi og qPCR af nogle vigtige CMs-genersekspression, alle fokuseret på ligheden mellem iCMs og CMs, men ikke direkte relateret til de funktionelle egenskaber ved iCMs. Desuden har disse metoder relativt komplicerede procedurer og er tidskrævende. Mens omprogrammering undersøgelser normalt indebærer en screening af potentielle omprogrammering faktorer, der fremmer iCMs modning11, hjerte omprogrammering opfordrer til en hurtig og bekvem metode baseret på iCMs funktion.
CMs åbne spænding-gated calcium ion kanaler på cytomembrane i løbet af hver ordregivende cyklus, hvilket fører til en forbigående tilstrømning af calcium ion (Ca2 +) fra den intercellulære væske til cytoplasma at deltage i myofilament sammentrækning. En sådan Ca2 + tilstrømning og outflux cyklus er det grundlæggende træk ved myokardiesammentrækning og udgør den normale funktion af CMs12. Således kan en metode, der registrerer Ca2 + tilstrømning være en potentiel måde at måle funktionen af DM’er og CM-lignende celler, herunder iCMs. For iCMs giver en sådan metode desuden en anden måde at evaluere omprogrammeringseffektiviteten på.
Genetisk kodede calciumindikatorer (GEFI’er) er blevet udviklet og i vid udstrækning anvendt til at angive celleaktiviteter, især handlingspotentialer. Generelt består GEFI’er af et Ca2+- bindingsdomæne som calmodulin, og et fluorescerende domæne som GFP, og GCaMP3 er et med høj affinitets- og fluorescensintensitet. GCaMP3’s fluorescensdomæne aktiveres, når den lokale calciumkoncentration ændres13. I dette papir, en mus stamme, der specifikt udtrykker en GCaMP3 reporter i Myh6 + celler er beskrevet. Ved at indføre MGT til de isolerede NCF’er fra nyfødte af denne stamme, kan omprogrammeringen overvåges af fluorescens, som med succes omprogrammeres iCMs vil udstille. En sådan musestamme og -metode vil give en værdifuld platform til at undersøge hjerte omprogrammering.
Evaluering af iCMs funktion er nødvendig for hjerte omprogrammering felt. I dette manuskript beskriver protokollen en Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J musestamme, der er blevet etableret, hvordan man bruger NCF’erne isoleret fra neonatale mus i denne stamme til omprogrammering til iMP’er og evaluering af iMP’er funktion ved Ca2+ flux. Dette er en de novo metode til at evaluere iCMs funktionelle modning.
Flere kritiske trin er vigtige for en…
The authors have nothing to disclose.
Vi sætter pris på Leo Gnatovskiys indsats for at redigere den engelske tekst til dette manuskript. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (NIH) i USA (1R01HL109054) tilskud til Dr. Wang.
15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |