Bir GCaMP3 Muhabiri ile Kardiyak Spesifik Kalsiyum Akısını Ölçerek Kardiyak Yeniden Programlamanın İn vitro Değerlendirmesi
Summary
Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF’ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM’ ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM’lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Kardiyak yeniden programlama, hasarlı bir kalbi onarmak için potansiyel olarak umut verici bir tedavi haline geldi. Fibroblastlar, Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) dahil olmak üzere birden fazla transkripsiyon faktörü sunarak indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM’ ler) yeniden programlanabilir. Bu iCM’ler, enfarktüslü bir kalpte yerinde üretildiğinde, elektriksel ve mekanik olarak çevredeki miyokardla bütünleşir ve yara izi boyutunda bir azalmaya ve kalp fonksiyonunda iyileşmeye yol ederim. iCM’lerin nispeten düşük yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi nedeniyle, iCM’lerin karakterizasyonu bir zorluk olmaya devam etmektedir. Akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere bu alanda şu anda kullanılan yöntemler, esas olarak kardiyak gen ve protein ekspresyonine odaklanır, ancak iCM’lerin fonksiyonel olgunlaşmasına odaklanmaz. Eylem potansiyelleri tarafından tetiklenen kardiyomiyositlerde voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılması hücreye hızlı bir kalsiyum akınına yol açar. Bu nedenle, kalsiyum akını oranını ölçmek kardiyomiyosit fonksiyonunu değerlendirmek için umut verici bir yöntemdir. Burada, protokol iCM işlevini kalsiyum (Ca2+) akı ile değerlendirmek için bir yöntem sunar. Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Myh6-olarak adlandırılır) geçilerek bir αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare suşu kuruldu Aşağıdaki cre) gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıda Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fareler ile. P0-P2 yenidoğan farelerinden yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF’ler) izole edildi ve in vitro olarak kültürlendi ve NCF’lere MGT’nin polistronik bir yapısı tanıtıldı ve bu da iCM’lere yeniden programlanmalarına yol açtı. Sadece başarıyla yeniden programlanan iCM’ler GCaMP3 muhabirini ifade edeceğinden, iCM’lerin fonksiyonel olgunlaşması floresan mikroskopi ile Ca2+ akı tarafından görsel olarak değerlendirilebilir. Yeniden programlanmamış NCF’lerle karşılaştırıldığında, NCF-iCM’ler CD’lere benzer şekilde önemli kalsiyum geçici akı ve spontan kasılma gösterdi. Bu protokol, fare zorlanması kuruluşu, yenidoğan fare kalplerinin izolasyonu ve seçimi, NCF izolasyonu, kardiyak yeniden programlama için retrovirüs üretimi, iCM indüksiyonu, muhabir hattımız kullanılarak iCM Ca2+ akısının değerlendirilmesi ve ilgili istatistiksel analiz ve veri sunumunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Burada açıklanan yöntemlerin kardiyak yeniden programlama çalışmaları için iCM’lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlaması beklanmaktadır.
Introduction
Miyokard enfarktüsü (MI) dünya çapında ağır bir hastalıktır. Kardiyovasküler hastalıklar (CVD’ ler) dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve 20191,2’de yaklaşık 18,6 milyon ölüme neden olmaktadır. CvD’lerin toplam mortalitesi son yarım yüzyıl içinde azaldı. Bununla birlikte, bu eğilim bazı gelişmemiş ülkelerde yavaşlatıldı ve hatta tersine çevrildi1, bu da CVD’lerin daha etkili tedavilerini gerektiriyor. CVD’nin ölümcül tezahürlerinden biri olarak MI, Amerika Birleşik Devletleri’ndeki CVD’lere atfedilen tüm ölümlerin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır2. İskemi sırasında, koroner arterlerin bloke edilmesi ve hem besin hem de oksijenin sınırlı tedariki ile miyokard ciddi metabolik değişikliklere uğrar, kardiyomiyositlerin (CM’ ler) sistolik işlevini bozar ve CM ölümüne yol açar3. Kalp yaralanmasını onarmak ve yaralı kalbin işlevini geri kazandırmak için kardiyovasküler araştırmalarda çok sayıda yaklaşım araştırıldı4. Doğrudan kardiyak yeniden programlama, hasarlı kalbi onarmak ve işlevini geri kazandırmak için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır5,6. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) tanıtılarak fibroblastlar iCM’lere in vitro ve in vivo olarak yeniden programlanabilir ve bu iCM’ler yara bölgesini azaltabilir ve kalp fonksiyonunu iyileştirebilir7,8.
Kardiyak yeniden programlama MI tedavisi için umut verici bir strateji olsa da, bir dizi zorluk devam etmektedir. İlk olarak, yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi her zaman beklendiği kadar yüksek değildir. MGT indüksiyonu, in vitro7’deki iCM’lere yeniden programlanacak toplam CF’lerin sadece% 8.4’ünü (cTnT+) veya% 24.7’sini (αMHC-GFP +) veya uygulamasını sınırlayan% 35’e kadar in vivo8 elde edebilir. Hand29 veya Akt1/PKB10 gibi sistemde daha fazla faktör indüklenmiş olsa bile, yeniden programlama verimliliği klinik bir ortamda kullanılmak üzere hala tatmin edici değildir. Bu nedenle, bu alanda yeniden programlama verimliliğini artırmaya odaklanan daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. İkincisi, iCM’lerin elektrik bütünlüğü ve kasılma özellikleri kalp fonksiyonunun verimli bir şekilde iyileştirilmesi için önemlidir, ancak bunların değerlendirilmesi zordur. Şu anda, bazı önemli CD genlerinin ekspresyonunun akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere alanda yaygın olarak kullanılan değerlendirme yöntemleri, iCM’lerin ve CD’lerin benzerliğine odaklanmıştır, ancak iCM’lerin fonksiyonel özellikleriyle doğrudan ilişkili değildir. Ayrıca, bu yöntemler nispeten karmaşık prosedürlere sahiptir ve zaman alıcıdır. Yeniden programlama çalışmaları genellikle iCM’lerin olgunlaşmasını teşvik eden potansiyel yeniden programlama faktörlerinin taranması içerir11, kardiyak yeniden programlama iCMs işlevine dayalı hızlı ve kullanışlı bir yöntem gerektirir.
CD’ler, her büzülme döngüsü sırasında sitomembran üzerindeki voltaj kapılı kalsiyum iyon kanallarını açar ve bu da miyofilament kasılmasına katılmak için hücreler arası sıvıdan sitoplazmaya geçici bir kalsiyum iyonu (Ca2+) akınına yol açar. Böyle bir Ca2+ akını ve dış döngü miyokard kasılmasının temel özelliğidir ve CMs12’nin normal işlevini oluşturur. Bu nedenle, Ca2+ akınını algılayan bir yöntem, iCM’ler de dahil olmak üzere CD’lerin ve CM benzeri hücrelerin işlevini ölçmenin potansiyel bir yolu olabilir. Ayrıca, iCM’ler için, böyle bir yöntem yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için başka bir yol sağlar.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI’ler) geliştirilmiş ve başta eylem potansiyelleri olmak üzere hücre aktivitelerini belirtmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genellikle, GECI’ler calmodulin gibi bir Ca2+ bağlama etki alanından ve GFP gibi floresan bir etki alanından oluşur ve GCaMP3 yüksek benzeşim ve floresan yoğunluğuna sahip bir etki alanıdır. GCaMP3’ün floresan etki alanı, lokal kalsiyum konsantrasyonu değiştiğinde etkinleştirilecektir13. Bu makalede, Myh6+ hücrelerinde özellikle bir GCaMP3 muhabirini ifade eden bir fare suşu açıklanmıştır. MGT’yi bu türün yenidoğanlarından izole edilmiş NCF’lere tanıtarak, yeniden programlama, başarılı bir şekilde yeniden programlanan iCM’lerin sergileyeceği floresan ile izlenebilir. Böyle bir fare zorlanması ve yöntemi, kardiyak yeniden programlamayı araştırmak için değerli bir platform sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kardiyak yeniden programlama alanı için iCM’lerin değerlendirilmesi gereklidir. Bu yazıda, protokolde bir Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J fare suşu, iCM’lere yeniden programlama için yenidoğan farelerden izole edilen NCF’lerin bu suşta nasıl kullanılacağı ve iCM işlevinin Ca2+ fluks tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu, iCM’lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için bir de novo yöntemidir.
Bu y?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Leo Gnatovskiy’nin bu makalenin İngilizce metnini düzenleme çabalarını takdir ediyoruz. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından Dr. Wang’a verilen hibe (1R01HL109054) tarafından desteklendi.
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| 6 Well Cell Culture Plates | Alkali Scientific | TP9006 | |
| A83-01 | Stemgent | 04–0014 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X800E | Inverted fluorescence microscope |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | A1113903 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder | Thermo Fisher Scientific | BP9706100 | |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 microbeads |
| Collagenase, Type 2 | Thermo Fisher Scientific | NC9693955 | |
| Counting Chamber | Thermo Fisher Scientific | 02-671-51B | Hemocytometer |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11960069 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14-040-133 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Thermo Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS) | Thermo Fisher Scientific | E478-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| IMDM media | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| IX73 Inverted Microscope | Olympus | IX73P2F | Inverted fluorescence microscope |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11-668-019 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Medium 199, Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACS Separator and Starting Kits | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore Sigma | SLHV033RB | |
| MM589 | Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan | ||
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line | Cell Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| Poly(ethylene glycol) | Millipore Sigma | P5413-1KG | PEG8000 |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | |
| PTC-209 | Sigma | SML1143–5MG | |
| Puromycin Dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| Recombinant Human IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| ST 16 Centrifuge Series | Thermo Fisher Scientific | 75-004-381 | |
| Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | 40 µm strainer |
| Surface Treated Tissue Culture Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB012921 | |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Trypan Blue solution | Millipore Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 |
Riferimenti
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
- Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
- Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
- Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
- Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
- Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
- Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
- Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036 (2016).
- Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426 (2015).
- Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
- Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
- Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505 (2011).
- Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312 (2016).
