Denne strømlinjeformede protokollen beskriver en arbeidsflyt for å oppdage og bildebakterier i komplekse vevsprøver, fra å fikse vevet til farging av mikrober med fluorescerende in situ hybridisering.
Måling av lokalisering av mikrober i deres in vivo-kontekst er et viktig skritt i å avsløre de funksjonelle forholdene mellom mikrobiota og virveldyr tarmen. Det romlige landskapet i tarmmikrobiota er tett kontrollert av fysiske egenskaper – tarmslim, krypter og folder – og påvirkes av vertskontrollerte egenskaper som pH, oksygentilgjengelighet og immunfaktorer. Disse egenskapene begrenser evnen til både commensale mikrober og patogener til å kolonisere tarmen stabilt. I mikron-skala bestemmer mikrobiell organisasjon nærområdet interaksjoner mellom forskjellige mikrober, samt samspillet mellom mikrober og deres vert. Disse interaksjonene påvirker deretter storskala organfunksjon og vertshelse.
Denne protokollen muliggjør visualisering av tarmmikrobiota romlig organisering fra avstander mellom celler til organomfattende skalaer. Metoden er basert på å fikse tarmvev samtidig som tarmstruktur og slimegenskaper bevares. De faste prøvene blir deretter innebygd, seksjonert og farget for å markere spesifikke bakteriearter gjennom fluorescens in situ hybridisering (FISH). Vertsfunksjoner, for eksempel slim og vertscellekomponenter, er merket med fluorescerende merkede lectins. Til slutt er de fargede delene avbildet ved hjelp av et konfokalt mikroskop ved hjelp av flisskanningsavbildning ved høy forstørrelse for å bygge bro mellom mikron og centimeter lengdeskalaer. Denne typen avbildning kan brukes på tarmseksjoner fra dyremodeller og biopsier fra humant vev for å bestemme mikrobiotaens biogeografi i tarmen i helse og sykdom.
Mikrobielle visualiseringsteknikker har opprinnelse som er like gamle som mikrobiologi selv, da Antonie Van Leeuwenhoek brukte mikroskopet sitt til å observere bakterier (som han kalte “animalcules”) fra tannplakk og avføring på 1600-tallet. Siden da har mange teknikker blitt utviklet for å visualisere den romlige organiseringen av konsortiet av bakterier, sopp og virus som lever forbundet med en vert-mikrobiota1. Å belyse lokaliseringen av disse mikrober er viktig for å bestemme deres funksjon i deres dyrevert. Biogeografien til bakterier er viktig i både commensal og patogen taxa, som nærhet til bestemte steder (f.eks. epitelet), ernæringsmessige substrater og spesifikke mikrober kan diktere bakteriell produksjon av metabolitter underliggende interarter og inter-kingdom interaksjoner.
En nøkkelstruktur som skiller bakterier og vertsvevet på flere forskjellige kroppssteder, for eksempel munnhulen, tarmen eller lungen, er slimet – et vertsprodusert lag som begge forhindrer mikrobiell translokasjon på vertsepiteringscellene og fungerer som en ernæringsmessig ressurs for mikrobiota2,3,4 . Karakterisering av brudd og endringer i denne barrieren er av avgjørende betydning, noe som fører til mekanistisk innsikt i vertsmikrobiotainteraksjoner som ikke ville bli oppnådd ved sekvensering alene5,6,7. For eksempel aktiverte avbildning oppdagelsen av at antibiotikaeksponering kan forstyrre slimlaget og mikrobiotaorganisasjonen7,8, og at avføringsmidler kan tømme slimet, korrelere med store endringer i immunparametere5.
Denne protokollen skisserer et generelt rammeverk for å fikse, fargelegge og avbilde mikrobiota og vertsvevet (figur 1), bygget på arbeidet til Johansson og Hansson9. Mens denne protokollen er modellert i sammenheng med tarmseksjoner, kan den lett tilpasses andre vevstyper. Denne protokollen muliggjør behandling av enten eksperimentelle dyr eller menneskelige kliniske prøver; notater for behandling av begge typer prøver er inkludert. I eksemplet som presenteres her, har vertsepitelet og luminalbakteriene samtidig blitt merket med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging, slim med fluorescein (FITC)-konjugert lectin, Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1), og en spesifikk bakteriell takson ved hjelp av FISK. FISH-sonder er vanligvis designet mot en taksonons 16S rRNA-gener for å sikre det høye signalet fra å binde en høykopiert transkripsjon.
I dette eksemplet retter sonden seg mot 16S rRNA i Muribaculaceae bakteriefamilien (figur 2). Flekkene erstattes imidlertid lett med forskjellige FISH-sonder og/eller lectins for å imøtekomme det aktuelle biologiske spørsmålet. Tidligere validerte FISH-sonder finnes på ProbeBase10, en online ressurs for rRNA-målrettede oligonukleotidprober, eller på SILVA11, en ribosomal RNA-database. For utforming av nye sonder kan leseren referere til nye rørledninger som HiPR-FISH8 eller Oligominer12. Ved hjelp av denne protokollen er det mulig å observere tett pakking av bakterier i tarmlumen og de forskjellige egenskapene til tarmslim i fordøyelseskanalen. Arbeidsflyten som er beskrevet her, muliggjør kvantitativ analyse av mikrobiota i den romlige konteksten til vertsmiljøet.
Protokollen beskrevet ovenfor gir en reproduserbar metode for å visualisere host-microbiota-grensesnittet. Disse analysene har hatt stor nytte av protokollutvikling, fra optimalisering av FISH-merking18 til slimbevaring og avbildning9. Fiksering og innebygging gir også nyttig lagring av prøver; Videre kan parafininfiltrerte kassetter sendes uten begrensninger, da prøvene er helt faste og inerte.
Betydning og alternative metoder
Kombinasjonen av FISK og slimfarging muliggjør analyse av mikrobiotasammensetning på bestemte vevssteder og samspillet mellom individuelle bakterier og verten. Alternative teknikker som involverer analyse av spesifikke steder i mikrobiota er vanligvis ikke i stand til å utforske encellet karakter av disse interaksjonene, for eksempel i tilfelle laserfangst mikrodeseksjon kombinert med sekvensering19. Sekvenseringsbaserte teknikker har imidlertid fordelen av å kunne fange den genetiske sminken av mikrobiota på et finere nivå og mer bredt enn 16S rRNA-sonder.
En fallgruve for protokollen som presenteres er at den gir et engangs øyeblikksbilde av mikrobiota i forhold til verten. For sanntidsavbildning hos levende dyr kreves det spesielle avbildningsteknikker for å lette oppkjøpet av et fluorescenssignal i dypt vev (f.eks. intravital tofotonmikroskopi og lysarkfluorescensmikroskopi20,21). I disse metodene er modellorganismen enten kolonisert med bakterier som er farget med molekyler som binder seg til deres konvolutt20 eller genetisk modifiserte bakterier som har fluorescerende proteiner21. I sistnevnte tilfelle er modning av fluorescensproteiner et sentralt problem, da de fleste standard fluorescerende proteiner krever oksygen for å avgi lys. Derfor er det nødvendig med modellorganismer som har minst nanaerobe miljøer (nanomolar konsentrasjon av oksygen), for eksempel den aerobe sebrafisken gut21.
I denne protokollen brukes metanol-Carnoy som et fikseringsmiddel i stedet for paraformaldehyd eller formalin fordi det ikke inneholder vann. Dette forhindrer hydrering, dehydrering og kollaps av slimlaget under behandling og letter nøyaktige målinger av slimtykkelse. Mens methacarn fiksering og parafin innebygging har blitt en standard i feltet, har forskjellige fikseringer og innebyggingsteknikker blitt undersøkt for å optimalisere slimbevaring9,22, med noen studier som indikerer at harpikser kan være bedre enn parafin innebygging22. En annen viktig begrensning for parafininnbygging og methacarnfiksering er tapet av fluorescence proteinfluorescens, som kan unngås ved å bruke alternative fikseringer (f.eks. formalin eller paraformaldehyd (PFA)) eller modifiserte innebyggingsteknikker23. Hvert rettingsmiddel har fordeler og ulemper, og valget av fixative avhenger av bildebehandlingsprioritetene. Bildemodaliteter kan kombineres hvis biologiske replikeringer er festet i enten PFA og methacarn og bilder er hentet fra begge prøvene.
FISK har blitt kombinert med immunfluorescens i isolerte tilfeller med spesifikke anti-Muc2C3 kaninpolyklonale antistoffer9,24. Disse resultatene har ikke blitt mye reprodusert med andre Muc2 antistoffer, noe som indikerer at valget av antistoffer kan være kritisk i suksessen til FISH-immunfluorescence kombinasjonen. Vilkårene for vellykket antistofffarging for et gitt antistoff tillater kanskje ikke oppbevaring av FISKEfarging.
Feilsøking
I denne protokollen representerer utvalgssamling, inndeling og farging kritiske trinn for å forhindre oppretting av bildeartefakter. For eksempel kan trykking på vevet ved innsamling og før innebygging føre til feilfordeling av mikrobiota og påvirke slimkvaliteten. Et annet viktig hensyn er å unngå å kombinere segmenter av svært forskjellige tykkelser i en enkelt kassett, for eksempel et relativt tomt stykke tynntarmen og en pellets i den distale tykktarmen. De forskjellige tykkelsene fører til vanskeligheter med avbildning: Etter innebygging kan tverrsnitt på en bestemt dybde for ett segment være på feil dybde for avbildning for det andre (f.eks. vil lumen være på forskjellige dybder for hvert vev) (figur 1B, C og figur 3A). Videre, for avbildning av dyremodellstolpellets, kan de pakkes inn i bukhinnemembran24. I denne teknikken brettes en liten del av nyisolert bukhinne forsiktig rundt avføringen og bevarer pelletsstrukturen under vasketrinnene som er skissert i protokollen.
I motsetning til behandling av dyrevev med innhold, gir avbildning av menneskelige tarmprøver noen utfordringer. Spesielt vil luminalt innhold og slimhinneforing sannsynligvis bli forstyrret av koloskopi tarmpreparatet som vanligvis utføres før tarmbiopsier eller reseksjonsprosedyrer. I tillegg, når biopsier samles inn, er det nyttig å merke seg vevsorienteringen for å hjelpe til med å identifisere spesifikke egenskaper (f.eks. lumen vs. submucosa) i fravær av tarminnhold. Pre-embedding med 3% agar og / eller agar: gelatin blandinger kan være nyttig for å opprettholde vev polaritet25; Det er imidlertid problemer med dehydrering og seksjonering av agar, som rapportert i litteraturen, og behandlingstidene må kanskje endres.
Et sentralt aspekt ved å oppnå god FISKEfarging kommer ved å justere formamidkonsentrasjonen for spesifikke FISKE-sonder. Formamid vil kontrollere hybridiseringsstrengen til FISH-sonder til sine mål. Det er viktig å sikre at a) riktig formamidkonsentrasjon er valgt for farging av et gitt samfunn, og b) at en passende formamidkonsentrasjon til og med er mulig for sondekombinasjonen som brukes – dette kan påvirke det optimale sondevalget når du bruker flere sonder. Nettsteder som mathFISH (http://mathfish.cee.wisc.edu/) kan hjelpe deg med å beregne de riktige formamidkonsentrasjonene for en gitt sonde. I mangel av informasjon om passende formamidkonsentrasjoner, kan denne protokollen testes med 0% og 10% formamid.
Seksjonering av de innebygde prøvene krever at blokken kuttes til tilstrekkelig dybde for å oppnå lysstykker, da det å dele for grunt inn i en blokk vil resultere i en tverrsnittsvisning av villi/krypter uten lystetthet (figur 3A). Flekk prøvene kort tid etter seksjonering for optimalt FISH-signal, og bruk fersk DAPI (eller DAPI lagret ved -20 °C) for å løse bakgrunnsproblemer (figur 3C). FISKEfarging av seksjoner som er mer enn en måned gammel, kan føre til dårligere/inkonsekvent farging.
Hvis vevet eller dekslene ikke er helt flate med hensyn til lysbildet, kan det hende at prøven ikke er i fokus i alle posisjoner i en flisskanning (figur 3B), noe som fører til bortkastet innsats og potensiell fotobleking. Dette kan løses ved å ta mindre flisskanninger der alle posisjoner er verifisert for å være i fokus. Seksjonering med kjedelige kniver kan også føre til løsrivelse av slim og lysende innhold, som vises som store mørke områder under avbildning. Til slutt kan fordampning av løsningen eller boblene under hybridiseringstrinnet føre til ujevn farging av FISH-sondene i vevet.
En annen kritisk parameter som påvirker effektiviteten til FISH-sondebindingen er konkurransen mellom ulike sonder. En nyttig kontroll for å verifisere at FISH-sonden merker bakterier er å undersøke colokaliseringen av signalet fra FISH-sonden med DAPI (figur 2C, D). I prøver som krever bruk av flere rRNA-sonder, blir justering av parametere som hybridiseringstemperatur, sondekonsentrasjon og formamid avgjørende for å sikre at sondene er bindende for de riktige artene effektivt18.
Merknader om avbildning
FISK-fargede bakterier visualiseres best ved hjelp av et konfokalt mikroskop og et mål om minst 40x forstørrelse. Mens 63x forstørrelse foretrekkes fremfor bildebakterier på enkeltcellenivå, kan 40x forstørrelse også brukes ved å maksimere den digitale zoomen eller bruke et superoppløsningssystem. Systemer utstyrt med superoppløsningsfunksjoner kan også gi sub-cellulær oppløsning av individuelle bakterieceller. Lavere forstørrelsesmål kan brukes for å få en generell følelse av bakteriell lokalisering og slimtykkelse.
Det anbefales også å anskaffe 16-biters bilder i stedet for 8-biters bilder, da det høyere dynamiske området vil bidra til å fange det brede spekteret av DAPI-signalet fra de ekstremt lyse kjernene i epitelet og det relativt svake signalet om lysbakterier. Bortsett fra å bruke bildeoppsettet beskrevet ovenfor, er en viktig bildebehandlingshensyn valget av fluoroforer. For best mulig separasjon mellom bakterielle typer, sørg for at fluoroforene som brukes ikke overlapper i eksitasjons- og utslippsspektra (med mindre avbildning på et system med evnen til å utføre lineær unmixing). I tillegg kan sonder brukes i kombinasjon (f.eks. kombinasjonen av en familiespesifikk sonde og en slektsspesifikk sonde) for å identifisere flere medlemmer av fellesskapet. Ved bruk av lineære, miksende eller validerte sonder er det viktig å teste nøyaktigheten og nivået av FISKEfarging på rene kulturer8,14.
Når bildene er samlet inn, er flere verktøy tilgjengelige for kvantitativ analyse av vertsmikrobiota-grensesnittet, for eksempel BacSpace26, HiPR-FISH8 og andre segmenteringsverktøy27. BacSpace er en MATLAB programvare som tillater segmentering av vev og luminal komponenter og fjerning av plantemateriale fra bilder26. Programmet gir også analyse av slimtykkelse i 2D og kvantifisering av romlig fordeling basert på pikselavstander i forskjellige kanaler26. På den annen side tillater HiPR-FISH Image Analysis-programvaren segmentering av FISH-fargede celler8. Til slutt kan andre bakteriesegmenteringsverktøy som er optimalisert for in vitro-eksperimenter27 også tilpasses denne applikasjonen.
Konklusjon
In situ imaging muliggjør kvantitativ analyse av individuell mikrobiell taxa i sammenheng med andre samfunnsmedlemmer og de ulike mikromiljøete skapt av kosthold, slim og vert epitelkrypter. Samspillet mellom organismer dikterer biologien til vertsrelaterte mikrobielle systemer og gir en viktig analyse av endring i disse strukturene under perturbasjon som har implikasjoner for helsen. Spesielt gir evnen til å avbilde mikrobiota in situ gjennom protokollen beskrevet ovenfor et utrolig vindu inn i mikrobiotaens biogeografi i forhold til dyreverten.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke Dr. Kristen Earle for uvurderlig teknikkutvikling, Amber Hann for feilsøkingshjelp, Dr. Jen Nguyen og Deanna Pepin for kritisk gjennomgang av manuskriptet, og Dr. Hesham Soliman og Rossi-laboratoriet ved University of British Columbia for å gi mikroskop tilgang. Forfatterne anerkjenner støtte fra CIHR Team Grant: Canadian Microbiome Initiative 2 (C.T.), Crohn’s og Colitis Canada (til C.T. og K.M.N.), CIFAR (til C.T. og K.M.N.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (til C.T.), Weston Foundation: Weston Family Microbiome Initiative (til C.T.), Paul Allen Distinguished Investigator Award (til C.T.).
Aluminum foil | |||
Chloroform | Fisher | C298-500 | Toxic |
Coplin jar | Fisher | 08-813E | |
Cover glass, 22 × 22 mm, no #1 | VWR | CA48366-227-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Resuspended to 5 mg/mL |
Empty pipette tip box(es) | To melt paraffin | ||
Ethanol, anhydrous, molecular grade | — | — | |
FISH probes | |||
FISH hybridization solution | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl, 0.01% (w/v) SDS in nuclease-free water. Optional addition of 5–50% (v/v) formamide |
FISH washing buffer | — | — | 20 mM Tris–HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl |
Fluorescently-labeled Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) lectin | Vector Laboratories | FL-1061 (Fluorescein-labeled) or RL-1062-2 (Rhodamine-labeled) | UEA-1 labels fucosylated glycans, so it is not appropriate for germ-free mice or for samples from fucosyltransferase 2 (FUT2)-deficient hosts. |
Forceps | |||
Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
Fumehood | |||
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Corrosive and flammable |
HybriSlip flexible plastic cover slips, 22 x 22 mm × 0.25 mm | Sigma Aldrich | GBL722222 | for FISH hybridization steps, can substitute glass coverslips |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Kimwipes | |||
Methanol | Fisher | A412 | Toxic and flammable |
Microtome | for sectioning | ||
Multipurpose Specimen Storage Containers, 473 mL | Fisher | 14-955-117A | Can substitute with a glass or polyethylene container of your choice. Methacarn is not compatible with polystyrene or metal. |
Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | Any nail polish should work |
Oven | Necessary range: 45-60 °C | ||
Paraffin: Leica Paraplast | Leica | 39601006 | |
PBS, Phosphate-buffered Saline (10x solution) | Fisher | BP3991 | Dilute to 1x for protocol |
Sodium chloride | Fisher | S271 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), 20% Solution, RNase-free | Invitrogen | AM9820 | |
Tissue-Loc HistoScreen Cassettes | Thermo Scientific | CA83009-999 | |
Trizma hydrochloride solution, 1M Tris-HCl, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2663-1L | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
Water, nuclease-free | Fisher | BP2484100 | |
Xylenes | Fisher | X3P-1GAL | Toxic and flammable |