Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano
Summary
I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all’interno del microambiente tumorale.
Abstract
I macrofagi associati al tumore (TAM) possono cambiare la loro espressione e il profilo delle citochine in base a stimoli esterni. Questa notevole plasticità consente a TAM di adattarsi ai cambiamenti in corso all’interno del microambiente tumorale. I macrofagi possono avere principalmente attributi pro-infiammatori (M1-like) o anti-infiammatori (M2-like) e possono passare continuamente tra questi due stati principali. I macrofagi simili a M2 all’interno dell’ambiente tumorale sono associati alla progressione del cancro e alla prognosi sfavorevole in diversi tipi di cancro. Molti metodi diversi per indurre la differenziazione e la polarizzazione delle cellule THP-1 sono utilizzati per studiare i meccanismi cellulari e intercellulari e gli effetti del TAM all’interno del microambiente dei tumori. Attualmente, non esiste un modello stabilito per la polarizzazione dei macrofagi M2-like utilizzando la linea cellulare THP-1 e i risultati dell’espressione e i profili delle citochine dei macrofagi a causa di determinati stimoli in vitro variano tra gli studi. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi M0 e per polarizzare ulteriormente le cellule in un fenotipo simile a M2 entro 14 giorni. Dimostriamo i cambiamenti morfologici delle cellule simili ai monociti THP-1, dei macrofagi differenziati e dei macrofagi polarizzati simili a M2 utilizzando la microscopia ottica. Questo modello è la base per modelli di linee cellulari che studiano gli effetti antinfiammatori della TAM e le loro interazioni con altre popolazioni cellulari del microambiente tumorale.
Introduction
I macrofagi associati al tumore (TAM) e il loro ruolo nell’infiammazione cronica, nell’insorgenza del cancro e nello sviluppo del tumore sono obiettivi importanti nella recente ricerca1,2. I monociti del sangue periferico che vengono reclutati nel microambiente tissutale del tumore in via di sviluppo si differenziano in macrofagi e possono essere polarizzati in due sottotipi principali di macrofagi3. Il macrofago attivato classicamente rappresenta il fenotipo M1-like principalmente pro-infiammatorio e il sottotipo M2-like attivato alternativamente mostra caratteristiche prevalentemente antinfiammatorie4. I macrofagi possono passare dinamicamente tra questi due fenotipi principali a seconda del loro metabolismo cellulare, con sottotipi intermedi con attributi sia infiammatori che antinfiammatori5. TAM rappresenta una popolazione eterogenea di entrambi i fenotipi. Una funzione di promozione del tumore e una prognosi sfavorevole in diversi tipi di tumori è, tuttavia, particolarmente associata ai macrofagi M2-like6,7,8.
I profili funzionali dei macrofagi e la loro interazione con altre cellule all’interno del microambiente tumorale sono complessi e difficili da catturare in un ambiente in continua evoluzione durante lo sviluppo tumorale in corso. Le linee cellulari possono fornire una popolazione cellulare omogenea con vitalità stabile in coltura, che può facilitare il processo di dimostrazione di meccanismi cellulari e intercellulari definiti. La linea cellulare THP-1 simile ai monociti è un sistema modello legittimo per i monociti umani primari9. Questa linea cellulare spontaneamente immortalata è stata ottenuta dal sangue periferico di un bambino di un anno con leucemia monocitica acuta9,10. La differenziazione e la polarizzazione delle cellule THP-1 sono state riportate da diversi studi e sono state eseguite in più modi diversi11,12,13,14. L’attivazione e, quindi, la polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M1-like è seguita da un meccanismo di rimbalzo antinfiammatorio compensatorio, promuovendo un fenotipo M2-like attraverso citochine prodotte da macrofagi infiammatori, come l’interleuchina 6 (IL-6) o l’itaconato15,16. Questo potrebbe servire come meccanismo di rottura per attenuare una risposta infiammatoria eccessiva dopo l’attivazione cellulare17. Il processo di differenziazione e polarizzazione dei monociti e delle cellule simili ai monociti THP-1 in un fenotipo antinfiammatorio simile a M2 è a sua volta accompagnato da stimoli pro-infiammatori che devono essere superati. Una risposta infiammatoria delle citochine può essere causata da stress meccanico18, come la modifica dei mezzi per rialimentare le cellule o l’aggiunta di composti chimici per differenziare le cellule THP-1, come il forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA), e indurre la produzione di fattore di necrosi tumorale α (TNFα), interleuchina 1β (IL-1β) o IL-619. Questo profilo alterato di espressione delle citochine come risposta alla PMA può influenzare e prevenire la successiva polarizzazione dei macrofagi20. Adeguati periodi di riposo, come riportato in precedenza dopo il trattamento con PMA, consentono a queste risposte infiammatorie di diminuire e facilitare la polarizzazione cellulare in un fenotipo 21 distinto simile aM2.
Questo protocollo dimostra un metodo per differenziare e polarizzare le cellule simili ai monociti THP-1 in un fenotipo M2-like di macrofagi entro 14 giorni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo sulla differenziazione e polarizzazione delle cellule simili ai monociti THP-1 entro 14 giorni fornisce un metodo per ottenere macrofagi con un fenotipo M2 distinto a causa della lunga incubazione del trattamento delle cellule con adeguati periodi di riposo tra i passaggi.
Alcuni passaggi sono fondamentali per questo protocollo. Il tempo di raddoppio dei monociti THP-1 è di circa 26 ore. Le cellule possono essere divise ad una densità cellulare di 9 x10 5/mL e de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il Price Institute of Surgical Research, Università di Louisville, è sostenuto finanziariamente dal John W. Price e Barbara Thruston Atwood Price Trust. Le fonti di finanziamento non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione e nella conduzione dello studio, nonché nella raccolta, gestione, analisi e interpretazione dei dati.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
Riferimenti
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