Makrofag differensiering og polarisering i en M2-lignende fenotype ved hjelp av en human monocyttlignende THP-1 leukemicellelinje
Summary
M2-lignende tumorrelaterte makrofager (TAM) er forbundet med tumorprogresjon og dårlig prognose hos kreft. Denne protokollen fungerer som en detaljert veiledning for å reprodusere og polarisere THP-1 monocyttlignende celler i M2-lignende makrofager innen 14 dager. Denne modellen er grunnlaget for å undersøke de antiinflammatoriske effektene av TAM i tumormikromiljøet.
Abstract
Tumorrelaterte makrofager (TAM) kan bytte uttrykk og cytokinprofil i henhold til ytre stimuli. Denne bemerkelsesverdige plastisiteten gjør det mulig for TAM å tilpasse seg pågående endringer i tumormikromiljøet. Makrofager kan enten primært ha proinflammatoriske (M1-lignende) eller antiinflammatoriske (M2-lignende) attributter og kan kontinuerlig bytte mellom disse to hovedtilstandene. M2-lignende makrofager i tumormiljøet er forbundet med kreftprogresjon og dårlig prognose i flere typer kreft. Mange forskjellige metoder for å indusere differensiering og polarisering av THP-1-celler brukes til å undersøke cellulære og intercellulære mekanismer og effekten av TAM i mikromiljøet av svulster. For tiden er det ingen etablert modell for M2-lignende makrofag polarisering ved hjelp av THP-1 cellelinjen, og resultatene av uttrykk og cytokinprofiler av makrofager på grunn av visse in vitro stimuli varierer mellom studier. Denne protokollen fungerer som detaljert veiledning for å skille THP-1 monocyttlignende celler i M0 makrofager og å polarisere celler ytterligere til en M2-lignende fenotype innen 14 dager. Vi demonstrerer de morfologiske endringene i THP-1 monocyttlignende celler, differensierte makrofager og polariserte M2-lignende makrofager ved hjelp av lett mikroskopi. Denne modellen er grunnlaget for cellelinjemodeller som undersøker de antiinflammatoriske effektene av TAM og deres interaksjoner med andre cellepopulasjoner av tumormikromiljøet.
Introduction
Tumorrelaterte makrofager (TAM) og deres rolle i kronisk betennelse, utbruddet av kreft og tumorutvikling er viktige mål i nyere forskning1,2. Perifere blodmonocytter som rekrutteres til vevsmikromiljøet til den utviklende svulsten, skiller seg ut i makrofager og kan polariseres til to hovedundertyper av makrofager3. Den klassisk aktiverte makrofagen representerer den hovedsakelig proinflammatoriske M1-lignende fenotypen, og den alternativt aktiverte M2-lignende undertypen viser overveiende antiinflammatoriske egenskaper4. Makrofager kan bytte dynamisk mellom disse to viktigste fenotypene avhengig av deres cellulære metabolisme, med mellomliggende undertyper som har både inflammatoriske og antiinflammatoriske attributter5. TAM representerer en heterogen populasjon av begge fenotypene. En tumorfremmende funksjon og dårlig prognose i ulike typer kreft er imidlertid spesielt forbundet med M2-lignende makrofager6,7,8.
De funksjonelle profilene til makrofager og deres interaksjon med andre celler i tumormikromiljøet er komplekse og utfordrende å fange i et kontinuerlig skiftende miljø under pågående tumorutvikling. Cellelinjer kan gi en homogen cellepopulasjon med stabil levedyktighet i kulturen, noe som kan lette prosessen med å demonstrere definerte cellulære og intercellulære mekanismer. Den monocyttlignende THP-1-cellelinjen er et legitimt modellsystem for primære menneskelige monocytter9. Denne spontant udødeliggjorte cellelinjen er hentet fra perifert blod fra et ett år gammelt spedbarn med akutt monocytisk leukemi9,10. Differensiering og polarisering av THP-1 celler har blitt rapportert av flere studier og har blitt utført på flere forskjellige måter11,12,13,14. Aktivering og derfor polarisering av makrofager i en M1-lignende fenotype etterfølges av en kompenserende antiinflammatorisk rebound-mekanisme, som fremmer en M2-lignende fenotype gjennom cytokiner produsert av inflammatoriske makrofager, som interleukin 6 (IL-6) eller itakonat15,16. Dette kan fungere som en pausemekanisme for å dempe en overskytende inflammatorisk respons etter celleaktivering17. Prosessen med å differensiere og polarisere monocytter og THP-1 monocyttlignende celler i en antiinflammatorisk M2-lignende fenotype er i seg selv også ledsaget av proinflammatoriske stimuli som må overvinnes. En inflammatorisk cytokinrespons kan skyldes mekanisk stress18, for eksempel endring av medier for å refeede cellene, eller legge til kjemiske forbindelser for å skille THP-1-celler, for eksempel phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), og indusere produksjon av tumornekrosefaktor α (TNFα), interleukin 1β (IL-1β) eller IL-66 19. Denne endrede cytokinuttrykksprofilen som svar på PMA kan påvirke og forhindre etterfølgende makrofagpolarisering20. Tilstrekkelige hvileperioder, som rapportert før etter PMA-behandling, tillater disse inflammatoriske responsene å redusere og lette cellepolarisering i en distinkt M2-lignende fenotype21.
Denne protokollen demonstrerer en metode for å differensiere og polarisere THP-1 monocyttlignende celler til en M2-lignende fenotype makrofager innen 14 dager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen om differensiering og polarisering av THP-1 monocyttlignende celler innen 14 dager gir en metode for å oppnå makrofager med en distinkt M2-lignende fenotype på grunn av lang behandlingsinkubasjon av celler med tilstrekkelig hvileperioder mellom trinnene.
Enkelte trinn er avgjørende for denne protokollen. Doblingstiden for THP-1 monocytter er ca. 26 timer. Celler kan deles med en celletetthet på 9 x 105/ml og bør frøs med en tetthet på 3 x 105/ml …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Price Institute of Surgical Research, University of Louisville, støttes økonomisk av John W. Price og Barbara Thruston Atwood Price Trust. Finansieringskildene hadde ingen rolle i utformingen og gjennomføringen av studien, så vel som i innsamling, ledelse, analyse og tolkning av dataene.
Materials
| 0.4% trypan blue | VWR, Radnor, USA | 152-5061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific, Ocala, USA | 1615-5510 | |
| 10 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-898 | |
| 1000 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1111-2821 | |
| 15 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-664 | |
| 20 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-1810 | |
| 200 μL TipOne pipet tips | USA Scientific, Ocala, USA | 1120-8810 | |
| 25 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-900 | |
| 5 mL serological pipet | VWR, Radnor, USA | 89130-896 | |
| 50 mL Centrifuge tube | VWR, Radnor, USA | 89039-662 | |
| Accutase solution 500 mL | Sigma, St. Louis, USA | A6964 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x), stabilized | Sigma, St. Louis, USA | A5955-100 mL | with 10,000 units penicillin, 10 mg of streptomycin and 25 μg of amphotericin B per mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Binder CO2 Incubator | VWR, Radnor, USA | C170-ULE3 | |
| CytoOne T-75cm flask with filter cap | USA Scientific, Ocala, USA | CC7682-4875 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma, St. Louis, USA | D8537-500 mL | PBS without calcium chloride and magnesium chloride should be used, since both can alter macrophage polarization |
| Eppendorf Centrifuge 5804 R (refrigerated) | Eppendorf, Enfield, USA | – | |
| Ethyl alcohol (70%) | – | – | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences, San Diego, USA | – | The flow cytometer operates with CellQuest software (BD Biosciences) |
| Falcon 24-well plate | VWR, Radnor, USA | 353504 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC, Manassas, USA | 30-2020 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, San Diego, USA | 555397 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| FITC Mouse Anti-Human CD80 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 557226 | Flow cytometry, M1 marker (100 tests) |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555748 | Flow cytometry, isotype control for CD80 (100 tests) |
| FITC Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 553456 | Flow cytometry, isotype control for CD14 (100 tests) |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences, San Diego, USA | 564220 | Flow cytometry, Fc block (0.25 mg) |
| Human interleukin 13 (IL-13) | R&D, Minneapolis, USA | IL-771-10 μg | |
| Human interleukin 4 (IL-4) | R&D, Minneapolis, USA | SRP3093-20 μg | |
| Labconco Biosafety Cabinet (Delta Series 36212/36213) | Labconco, Kansas City, USA | – | |
| L-Glutamine Solution, 200 mM | ATCC, Manassas, USA | 30-2214 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 | Sigma, St. Louis, USA | L2630-100 mg | |
| Mini Cell Scrapers | Biotium, Fremont, USA | 22003 | |
| Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific, Waltham, USA | 02-671-5 | |
| Nikon Eclipse inverted microscope TS100 | Nikon, Melville, USA | – | |
| Nuclease-free water | Invitrogen, Carlsbad, USA | AM9937 | |
| Olympus Light Microscope RH-2 | Microscope Central, Feasterville, USA | 40888 | |
| P10 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76180-014 | |
| P1000 variable pipet-Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-990 | |
| P200 variable pipet- Gilson | VWR, Radnor, USA | 76177-988 | |
| PE Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, San Diego, USA | 555388 | Flow cytometry, myeloid cell marker (100 tests) |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD Biosciences, San Diego, USA | 555749 | Flow cytometry, isotype control for CD11b (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse Anti-Human CD206 | BD Pharmingen, San Diego, USA | 551136 | Flow cytometry, M2 marker (100 tests) |
| PE-Cy 5 Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Pharmingen, San Diego, USA | 555750 | Flow cytometry, isotype control for CD206 (100 tests) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, St. Louis, USA | P8139 | |
| Powerpette Plus pipettor | VWR, Radnor, USA | 75856-448 | |
| Precision Water bath (model 183) | Precision Scientific, Chicago, USA | 66551 | |
| RPMI-1640 Medium | ATCC, Manassas, USA | 30-2001 | |
| THP-1 cell line, American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC, Manassas, USA | TIB-202 |
Riferimenti
- Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273 (2019).
- Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B. Crosstalk between cancer and immune cells: Role of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Cancer Medicine. 8 (10), 4709-4721 (2019).
- Soncin, I., et al. The tumor microenvironment creates a niche for the self-renewal of tumor-promoting macrophages in colon adenoma. Nature Communications. 9 (1), 582 (2018).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).
- Mazzone, M., Menga, A., Castegna, A. Metabolism and TAM functions-it takes two to tango. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (4), 700-716 (2018).
- Eum, H. H., et al. Tumor-promoting macrophages prevail in malignant ascites of advanced gastric cancer. Experimental and Molecular Medicine. 52 (12), 1976-1988 (2020).
- Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141 (1), 39-51 (2010).
- Scheurlen, K. M., Billeter, A. T., O’Brien, S. J., Galandiuk, S. Metabolic dysfunction and early-onset colorectal cancer – how macrophages build the bridge. Cancer Medicine. 9 (18), 6679-6693 (2020).
- Bosshart, H., Heinzelmann, M. THP-1 cells as a model for human monocytes. Annals of Translational Medicine. 4 (21), 438 (2016).
- . The American Type Culture Collection (ATCC) Available from: https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx#generalinformation (2021)
- Baxter, E. W., et al. Standardized protocols for differentiation of THP-1 cells to macrophages with distinct M(IFNgamma+LPS), M(IL-4), and M(IL-10) phenotypes. Journal of Immunological Methods. 478, 112721 (2020).
- Genin, M., Clement, F., Fattaccioli, A., Raes, M., Michiels, C. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer. 15, 577 (2015).
- Starr, T., Bauler, T. J., Malik-Kale, P., Steele-Mortimer, O. The phorbol 12-myristate-13-acetate differentiation protocol is critical to the interaction of THP-1 macrophages with Salmonella Typhimurium. PLoS One. 13 (3), 0193601 (2018).
- Lund, M. E., To, J., O’Brien, B. A., Donnelly, S. The choice of phorbol 12-myristate 13-acetate differentiation protocol influences the response of THP-1 macrophages to a pro-inflammatory stimulus. Journal of Immunological Methods. 430, 64-70 (2016).
- Yin, Z., et al. IL-6/STAT3 pathway intermediates M1/M2 macrophage polarization during the development of hepatocellular carcinoma. Journal of Cellular Biochemistry. 119 (11), 9419-9432 (2018).
- O’Neill, L. A. J., Artyomov, M. N. Itaconate: the poster child of metabolic reprogramming in macrophage function. Nature Reviews Immunology. 19 (5), 273-281 (2019).
- Luig, M., et al. Inflammation-induced IL-6 functions as a natural brake on macrophages and limits gn. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1597-1607 (2015).
- Maruyama, K., Nemoto, E., Yamada, S. Mechanical regulation of macrophage function – cyclic tensile force inhibits NLRP3 inflammasome-dependent IL-1beta secretion in murine macrophages. Inflammation and Regeneration. 39, 3 (2019).
- Gatto, F., et al. PMA-Induced THP-1 Macrophage Differentiation is Not Impaired by Citrate-Coated Platinum Nanoparticles. Nanomaterials (Basel). 7 (10), (2017).
- Maess, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli. Journal of Immunological Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).
- Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668 (2010).
- Raggi, F., et al. Regulation of human macrophage M1-M2 polarization balance by hypoxia and the triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Frontiers in Immunology. 8, 11097 (2017).
- Neutelings, T., Lambert, C. A., Nusgens, B. V., Colige, A. C. Effects of mild cold shock (25 degrees C) followed by warming up at 37 degrees C on the cellular stress response. PLoS One. 8 (7), 69687 (2013).
- Kurashina, Y., et al. Enzyme-free release of adhered cells from standard culture dishes using intermittent ultrasonic traveling waves. Communications Biology. 2, 393 (2019).
- Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunological Methods. 426, 56-61 (2015).
- Bailey, J. D., et al. Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology. Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).
