Analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici in cellule di cancro cervicale SiHa trattate con attinomicina D

Summary

L'apoptosi può essere caratterizzata dall'analisi citometrica a flusso di biomarcatori apoptotici precoci e tardivi. La linea cellulare del cancro cervicale, SiHa, è stata analizzata per i biomarcatori dell'apoptosi dopo il trattamento con actinomicina D utilizzando un citometro a flusso da banco.

Abstract

I biomarcatori dell'apoptosi sono stati studiati nelle cellule di cancro cervicale SiHa trattate con actinomicina D utilizzando un citometro a flusso da banco. I primi biomarcatori (Annexin V e potenziale di membrana mitocondriale) e i biomarcatori tardivi (caspasi 3 e 7 e danno al DNA) di apoptosi sono stati misurati in colture sperimentali e di controllo. Le colture sono state incubate per 24 ore in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO₂. Le cellule sono state quindi staccate utilizzando tripsina ed enumerate utilizzando un test di conteggio delle cellule citometriche a flusso. Le cellule sono state ulteriormente analizzate per l'apoptosi utilizzando un test di Annexin V, un saggio del potenziale transmembrana elettrochimico mitocondriale, un test della caspasi 3/7 e un test di danno al DNA. Questo articolo fornisce una panoramica dell'apoptosi e della citometria a flusso tradizionale ed elabora protocolli citometrici a flusso per l'elaborazione e l'analisi delle cellule SiHa. I risultati descrivono dati sperimentali positivi, negativi e sub-ottimali. Vengono inoltre discussi l'interpretazione e le avvertenze nell'esecuzione dell'analisi citometrica a flusso dell'apoptosi utilizzando questa piattaforma analitica. L'analisi citometrica a flusso fornisce una misurazione accurata dei biomarcatori precoci e tardivi per l'apoptosi.

Introduction

L'apoptosi, classificata come morte cellulare programmata di tipo 1¹, assicura un equilibrio tra proliferazione cellulare e morte cellulare². L'apoptosi è essenziale durante lo sviluppo umano, post-infortunio e per la prevenzione di malattie come il cancro³. Le vie di segnalazione della morte cellulare apoptotica intrinseca ed estrinseca⁴ causano cambiamenti intracellulari sequenziali biochimici e morfologici ^2,5,6. Le caratteristiche morfologiche apoptotiche possono essere identificate al microscopio e la perturbazione biochimica può essere analizzata mediante saggi biochimici, compresa la citometria a flusso (FC)⁷.

L'analisi citometrica a flusso per identificare l'apoptosi e comprendere i meccanismi intracellulari associati è cresciuta negli ultimi due decenni⁸. FC è una metodologia scientifica che analizza le cellule in un fluido che passa attraverso laser monocanale o multicanale (Figura 1)9,10,11. Le cellule nel fluido sono focalizzate in un unico file dal sistema fluidico del citometro a flusso utilizzando la focalizzazione idrodinamica. Mentre le cellule passano attraverso il laser, la luce viene dispersa o emessa dalle cellule. La luce diffusa può essere nella direzione in avanti (diffusione in avanti) o verso il lato (dispersione laterale) e fornisce informazioni sulla dimensione della cella e sulla granularità della cella o sulle strutture interne, rispettivamente.

Inoltre, i reagenti fluorescenti, come coloranti fluorescenti o anticorpi marcati con fluorofori, rilevano specifiche strutture o molecole superficiali o intracellulari. Quando il laser eccita i fluorofori, la luce viene emessa a una lunghezza d'onda specifica. I rivelatori, comunemente tubi fotomoltiplicatori, quantificano la luce diffusa ed emessa dai campioni cellulari. I rivelatori producono una corrente quantificabile proporzionale alla dispersione della luce e all'emissione di fluorescenza. L'uscita elettronica viene convertita in segnali digitali da un software di calcolo per identificare le popolazioni cellulari in base alle dimensioni delle cellule, alla granularità cellulare e alla fluorescenza cellulare relativa delle molecole marcate con fluorofori 9,12,13.

Figura 1: Schema che descrive il funzionamento tecnico e il flusso di lavoro della citometria a flusso tradizionale. Le cellule sono colorate con reagenti fluorescenti e sondate da un laser. I segnali di fluorescenza generati vengono rilevati e convertiti in un'uscita elettronica, che viene ulteriormente digitalizzata e analizzata da software informatici e programmi statistici. Abbreviazioni: FSC = forward scatter; SSC = dispersione laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

FC è utilizzato sia nella ricerca che nella diagnostica sanitaria. I due obiettivi della FC in necrobiologia sono la spiegazione delle proprietà molecolari e funzionali della morte cellulare e la discriminazione delle varie modalità di morte cellulare 14,15,16,17,18. Le applicazioni FC includono l'enumerazione cellulare, l'ordinamento delle popolazioni cellulari, l'immunofenotipizzazione, il rilevamento di biomarcatori (ad esempio, biomarcatori dell'apoptosi), studi di tossicità e ingegneria proteica¹². Inoltre, FC è comunemente applicato alla diagnostica sanitaria per aiutare con la diagnosi e il monitoraggio dei pazienti con neoplasie ematologiche. I progressi nella strumentazione, nel rilevamento dei fluorofori e nei sistemi di rilevamento dei rivelatori stanno espandendo le applicazioni FC per includere la citometria di imaging, la citometria di massa e la citometria spettrale con applicazioni di ricerca più ampie¹².

L'analisi citometrica a flusso dell'apoptosi offre vantaggi rispetto alle tecniche tradizionali utilizzate nella valutazione della salute cellulare. FC può analizzare molte singole cellule in un campione eterogeneo in modo rapido e riproducibile per stimare l'apoptosi ^3,5. La capacità di FC di fornire informazioni quantitative sui fenotipi cellulari su base cellulare ed evitare l'analisi di massa, offre una sensibilità superiore al Western blotting, ai saggi immunoassorbenti enzimatici (ELISA), alla fluorometria e alle tecniche di spettrofotometria utilizzate nell'analisi dell'apoptosi ^8,19. Inoltre, la relativa facilità di analisi FC in contrasto con i passaggi manuali ingombranti e scarsamente riproducibili di Western blot e ELISA è vantaggiosa. L'analisi riproducibile, accurata e ad alto rendimento della FC è quindi utile nella ricerca sul cancro²⁰.

FC consente inoltre l'analisi simultanea dei parametri del ciclo cellulare per popolazioni cellulari apoptotiche sane e anormali²¹. Poiché l'apoptosi è un processo dinamico, diversi metodi possono produrre risultati variabili e dipendono dal punto temporale in cui le cellule vengono raccolte²². La valutazione quantitativa simultanea di più parametri del fenotipo cellulare consente di rilevare sottopopolazioni minori con elevata precisione, ad esempio, possono essere rilevati sottogruppi cellulari rari con una bassa frequenza dello 0,01%²³. L'analisi FC multiparametrica è particolarmente utile in quanto la morte apoptotica si verifica lungo uno spettro di cambiamenti biochimici precoci e tardivi con cellule in vari punti lungo il continuum apoptotico. Ad esempio, l'uso della doppia colorazione utilizzando Annexin V e ioduro di propidio nell'analisi FC delle cellule apoptotiche consente la categorizzazione delle cellule apoptotiche precoci, delle cellule apoptotiche tardive e delle cellule morte²⁴. Il rilevamento accurato dell'apoptosi in più fasi evita errori di classificazione e risultati falsi negativi. Pertanto, l'analisi multiparametrica mediante FC migliora la specificità complessiva della rilevazione dei fenotipi cellulari ed evita l'errata classificazione delle popolazioni minori. Inoltre, la selezione cellulare mediante FC consente l'isolamento di popolazioni cellulari con elevata purezza per analisi successive⁷.

Lo svantaggio della FC include l'uso di cellule in sospensione, che può essere difficile nell'analisi dei tessuti, poiché la disaggregazione del tessuto nelle cellule può alterare la funzione cellulare¹⁹. Inoltre, la mancanza di standardizzazione della configurazione degli strumenti FC, dell'analisi dei dati e dei rapporti di analisi può causare variazioni nei risultati¹⁹, sottolineando la necessità di formare in modo ottimale gli operatori FC per eseguire, analizzare e segnalare i dati. Ad esempio, la capacità di FC di discriminare i veri detriti apoptotici dai nuclei apoptotici richiede i) impostazioni di acquisizione appropriate, ii) l'uso di perline di calibrazione per identificare un picco di DNA diploide e iii) controlli cellulari negativi e positivi che sono specifici della cellula³. Inoltre, l'analisi multiparametrica è limitata dal numero di rivelatori e deve essere eseguita una compensazione ottimale per evitare risultati non specifici e ricadute dell'emissione fluorescente quando si utilizzano più reagenti fluorescenti²⁵. I progressi nella tecnologia degli strumenti e dei fluorofori hanno migliorato il rilevamento dei parametri a 30 parametri¹².

L'identificazione della morte cellulare apoptotica non è sempre semplice⁷ e dovrebbero essere considerati biomarcatori sensibili e specifici. Il Nomenclature Committee on Cell Death (NCCD) raccomanda di utilizzare più di un test per studiare e quantificare il processo di apoptosi²⁶. Si raccomanda anche l'analisi al microscopio per le caratteristiche apoptotiche classiche²⁶ per confermare l'apoptosi ed evitare risultati falsi positivi⁷. Quattro caratteristiche biochimiche cardinali che abbracciano eventi apoptotici precoci e tardivi sono (1) perdita di asimmetria della membrana cellulare; (2) potenziale di dissipazione della membrana mitocondriale (ΔΨm); (3) attivazione della caspasi; e (4) danni al DNA²⁶.

Durante l'apoptosi precoce, la fosfatidilserina viene esternalizzata alla membrana cellulare esterna 27 e può essere rilevata mediante Annexin V marcata fluorescentmente con ficoeritrina^27,28,29. Inoltre, la doppia colorazione con il colorante fluorescente legante il DNA, 7-amminoactinomicina D (7-AAD), distingue le cellule vive, tardive-apoptotiche e morte. Pertanto, le cellule precocemente apoptotiche risultano positive per l'annessina V e negative per il 7-AAD, a differenza delle cellule tardive-apoptotiche, che risultano positive per entrambi i coloranti²⁴.

I segnali apoptotici intrinseci inducono la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm). Il ΔΨm interrotto provoca il rilascio di proteine pro-apoptotiche precoci dallo spazio intermembrana mitocondriale nel citosol^27,29,30. La variazione di ΔΨm può essere valutata mediante doppia colorazione con colorante lipofilo caricato positivamente, tetrametilrodamina estere etilico, TMRE e 7-AAD. Il colorante TMRE si accumula all'interno della membrana interna dei mitocondri intatti quando il potenziale di membrana è elevato. I mitocondri depolarizzati dimostrano una diminuzione della fluorescenza. Le cellule vive con mitocondri polarizzati (membrana mitocondriale intatta) sono positive per TMRE e negative per 7-AAD. Le cellule morte con mitocondri depolarizzati sono negative per TMRE e positive per 7-AAD³¹.

Le caspasi sono una famiglia di proteasi intracellulari che, quando attivate, segnalano ed eseguono l'apoptosi^26,27. Le caspasi del boia terminale (3,6,7) effettuano l'apoptosi tardiva 29,32,33. Le attività di caspasi-3 e -7 possono essere misurate da un substrato marcato fluorescente, che, una volta scisso, si lega al DNA ed emette un segnale fluorescente. Inoltre, qualsiasi compromissione dell'integrità della membrana cellulare può essere valutata mediante colorazione con 7-AAD. Le cellule apoptotiche sono positive per il colorante legante il DNA ma negative per il 7-AAD. Le cellule tardive-apoptotiche e morte sono positive per entrambi i coloranti³⁴.

L'apoptosi tardiva è caratterizzata da danno al DNA^27,29,35, che può essere valutato mediante ataxiatelangiectasia fosforilata chinasi mutata (ATM) e istone H2A.X. Le rotture del DNA a doppio filamento (DSB) causano fosforilazione di H2A.X. Anticorpi marcati con fluorescenza contro ATM e H2A. X può determinare il danno al DNA. Rilevamento negativo sia di ATM che di H2A. X indica nessun danno al DNA, mentre il rilevamento di entrambi i coloranti indica la presenza di rotture a doppio filamento nel DNA³⁶.

L'actinomicina D è un potente induttore dell'apoptosi e agisce legandosi al DNA per bloccare gli eventi di trascrizione e traduzione³⁷. Questo studio mirava a valutare l'apoptosi biochimica indotta dall'actinomicina D nella linea cellulare SiHa analizzando i biomarcatori in fase iniziale e avanzata dell'apoptosi. Quattro biomarcatori biochimici di apoptosi hanno valutato i passaggi sequenziali nella cascata apoptotica che includevano la perdita di asimmetria della membrana cellulare, il cambiamento nel potenziale della membrana mitocondriale, l'attivazione delle caspasi terminali e il danno al DNA.

Protocol

NOTA: Questo protocollo descrive le fasi della preparazione cellulare, dell'enumerazione cellulare, della colorazione cellulare e dell'analisi delle cellule SiHa trattate con actinomicina D utilizzando saggi commerciali citometrici a flusso misurati e analizzati su un citometro a flusso da banco (Figura 2).

Figura 2: Flusso di lavoro per la rilevazione di biomarcatori apoptotici biochimici mediante citometria a flusso. Le cellule vengono coltivate e trattate come descritto nella fase 1.1 del protocollo. (1) Le cellule vengono coltivate, (2) enumerate e (3) colorate con reagenti fluorescenti e (4) analizzate da un citometro a flusso da banco. I dati vengono ulteriormente controllati e analizzati statisticamente. Abbreviazioni: 7-AAD = 7-aminoactinomicina D; PBS = soluzione salina tamponata fosfato; PE = Ficoeritrina; TMRE = tetrametilrodamina estere etilico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Preparazione di colture cellulari e trattamenti per citometria a flusso

NOTA: Assicurarsi di seguire la tecnica asettica durante la manipolazione di colture cellulari.

1. Coltivare colture cellulari in un ambiente umidificato di CO 2 a 37 °C con il 5% di CO₂. Assicurarsi che la coltura cellulare sia circa il 70% confluente nel pallone genitore prima di passare le cellule per gli esperimenti.
2. Rimuovere il mezzo dal pallone, lavare le celle con 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) e aggiungere 500 μL di tripsina per staccare le cellule. Dopo che le cellule iniziano a girare e staccarsi dal pallone, battere bruscamente la base del pallone sul banco per staccare le celle. Quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo circa 5 ml di terreno di coltura fresco integrato con siero fetale al 10% prima di contare le cellule.
3. Cellule seme a 15.000 cellule/ml in 3 ml di terreno di coltura cellulare in una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti. Incubare le piastre di coltura durante la notte a 37 °C con il 5% di CO₂ per consentire l'attacco delle cellule al fondo del pozzetto.
4. Trattare le colture sperimentali con 100 ng/mL di actinomicina D e i controlli del terreno e del solvente rispettivamente con terreno di coltura fresco e dimetilsolfossido (DMSO), per 24 ore. Raccogliere il mezzo esaurito in un tubo da 15 ml e lavare le celle con 1x PBS. Successivamente, aggiungere il lavaggio PBS 1x al tubo, quindi aggiungere 500 μL di tripsina al pozzetto. Quindi, neutralizzare la tripsina aggiungendo 5 ml di terreno di coltura fresco.
   NOTA: (1) L'incubazione prolungata della tripsina o la neutralizzazione incompleta possono digerire le cellule e compromettere la loro membrana cellulare, che può distorcere i risultati. Inoltre, può anche cambiare l'asimmetria della membrana cellulare e, quindi, l'accessibilità alla fosfatidilserina. (2) Le cellule che si sono staccate e galleggiano in superficie possono essere incluse nell'analisi successiva centrifugando il mezzo rimosso a 300 × g per 5 minuti e risospendendo le cellule in terreno di coltura fresco.

2. Enumerazione delle cellule mediante il saggio di vitalità

1. Pipettare 450 μL di ioduro di propidio in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 50 μL della sospensione cellulare al tubo della microcentrifuga. Incubare il tubo a temperatura ambiente per 5 min. Enumerare le cellule mediante citometria a flusso (fare riferimento al paragrafo 4).
2. Diluire tutti i campioni ad una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule/ml con terreno di coltura cellulare prima di procedere ai test di apoptosi.

3. Colorazione delle cellule per citometria a flusso

NOTA: le condizioni sterili non sono richieste per questa parte del protocollo.

1. Rilevazione dell'esternalizzazione della fosfatidilserina mediante annessina V
   1. Aggiungere 100 μL di sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 100 μL di una miscela 1:1 di Annexin V coniugata fluorescente e reattivo 7-AAD. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, al riparo dalla luce.
2. Analisi della depolarizzazione della membrana mitocondriale
   1. Centrifugare 100 μL della sospensione cellulare a 300 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
   2. Risospendere le cellule in 1 mL di 1x PBS, aggiungere 100 μL di soluzione colorante TMRE a ciascun campione e mescolare la sospensione mediante back-pipettaggio delicato.
   3. Incubare le cellule per 20 minuti in ambiente CO₂ umidificato a 37 °C. Avvolgere i campioni in un foglio di alluminio pulito per proteggerli dalla luce.
      NOTA: Il potenziale della membrana mitocondriale è un marcatore funzionale sensibile a piccoli cambiamenti nell'ambiente cellulare. Pertanto, i campioni devono essere incubati e misurati in condizioni identiche (temperatura, pH e tempo trascorso tra l'inizio dell'incubazione e la misurazione fluorescente) per mantenere la riproducibilità). Inoltre, si noti che una protezione inadeguata dei campioni dalla luce provoca il fotosbiancamento dei fluorofori con conseguente fluorescenza emessa falsamente bassa.
   4. Dopo l'incubazione, aggiungere 5 μL della soluzione colorante 7-AAD a ciascun campione e mescolare. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
3. Rilevamento di caspasi-3 e -7 terminali attivati utilizzando il substrato di caspasi DEVD
   NOTA: le seguenti soluzioni vengono preparate prima di eseguire questo test.
   1. Diluire il peptide legante il DNA legato al DEVD in DMSO in un rapporto di 1:8 con 1x PBS sterile per rendere la soluzione di rilevamento della caspasi funzionante. Conservare la soluzione su ghiaccio o a 2-8 °C, al riparo dalla luce.
      NOTA: Ogni campione richiederà 5 μL di questa soluzione.
   2. Aggiungere 2 μL di una soluzione madre 7-AAD a 148 μL di 1x PBS per ottenere la soluzione di lavoro 7-AAD. Conservare la soluzione su ghiaccio o a 2-8 °C, al riparo dalla luce.
      NOTA: Ogni campione richiederà 150 μL di questa soluzione.
   3. Centrifugare 50 μL della sospensione cellulare per 5 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 50 μL di 1x PBS, seguiti da 5 μL della soluzione di lavoro per il rilevamento della caspasi. Mescolare accuratamente.
   4. Allentare il tappo dei tubi e incubare per 30 minuti in ambiente CO₂ umidificato a 37 °C, al riparo dalla luce. Aggiungere 150 μL della soluzione di lavoro 7-AAD a ciascun campione e miscelare. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
4. Rilevamento di rotture del DNA a doppio filamento e danni totali al DNA
   1. Centrifugare 50 μL della sospensione cellulare per 5 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante.
   2. Risospendere le cellule in 500 μL di 1x PBS. Aggiungere 500 μL di un tampone di fissazione a base di formaldeide e mescolare. Incubare i campioni su ghiaccio per 10 minuti.
   3. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 90 μL di 1x PBS in una provetta da microcentrifuga. Aggiungere 10 μL della soluzione anticorpale alla provetta della microcentrifuga. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.
   4. Aggiungere 100 μL di 1x PBS e centrifugare per 5 minuti a 300 × g. Scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 200 μL di 1x PBS.

4. Eseguire campioni sul citometro a flusso.

1. Verificare le prestazioni analitiche del citometro a flusso eseguendo il kit di controllo del sistema dello strumento. Non procedere con l'esecuzione dei campioni fino a quando tutti i controlli non sono stati completati e superati.
2. Individuare il saggio desiderato sfogliando il catalogo di saggi pre-programmati sullo strumento e selezionare Esegui test.
   1. Mescolare il campione mediante back-pipettaggio delicato prima di caricare il campione sul citometro a flusso.
      NOTA: Una miscelazione adeguata assicura che le cellule rimangano in sospensione e prevenga un basso numero di cellule.
   2. Innanzitutto, caricare un campione di controllo negativo sul citometro a flusso e selezionare Esegui (Regola impostazioni) in modo che lo strumento inizi ad aspirare il campione e fornisca un'anteprima in tempo reale degli eventi rilevati. Fare riferimento alla tabella dei materiali per il nome e i dettagli dello strumento.
   3. Utilizzando l'anteprima dal vivo, regolare le soglie per la fluorescenza e le dimensioni delle cellule e disegnare un cancello rettangolare attorno alla popolazione cellulare. Trascina l'indicatore di soglia per escludere i detriti cellulari. Selezionare Avanti (Imposta profilo sanitario) per procedere.
      NOTA: è importante conoscere la dimensione delle celle. Trascina i cursori e osserva i cambiamenti nel modo in cui gli eventi rilevati vengono tracciati nell'anteprima in tempo reale, poiché ciò informerà una selezione accurata delle soglie. Se i detriti cellulari non sono esclusi in questa fase, non possono essere rimossi nelle analisi post-acquisizione.
   4. Tocca e trascina i marcatori del quadrante per separare le popolazioni di celle e in modo che lo strumento tragga gli eventi rilevati in tempo reale. Utilizzare questi grafici per guidare l'utente finale sul posizionamento appropriato dei marcatori del quadrante. Selezionare Avanti (Verifica campioni) per procedere in modo che lo strumento visualizzi un riepilogo delle impostazioni. Dopo aver esaminato le impostazioni, seleziona Avanti (Verifica impostazioni) per applicare queste impostazioni a tutti gli esempi all'interno dell'esperimento.
      NOTA: Lo strumento fornisce un'anteprima live di 2 minuti delle celle utilizzate per regolare le impostazioni dello strumento. Se questo limite di tempo scade, lo strumento rilascerà il campione e i passaggi 4.2.2-4.2.4 dovranno essere ripetuti. Rimuovere il campione e mescolare bene prima di ricaricare e continuare.
   5. Blocca una popolazione di cellule disegnando una regione attorno alla popolazione cellulare. Regola le soglie per la fluorescenza e le dimensioni delle celle utilizzando i cursori situati sugli assi x e y dell'anteprima dal vivo. Applica queste impostazioni a tutti gli esempi all'interno dell'esperimento.
   6. Miscelare delicatamente il primo campione mediante backpipettaggio e caricare il primo campione sul citometro a flusso e selezionare Avanti. Assegnare un nome all'esempio e selezionare Esegui in modo che il sistema inizi a eseguirlo.
      NOTA: lo strumento può eseguire un solo campione alla volta.
   7. Una volta eseguiti tutti gli esempi, salvare l'esperimento assegnandogli un titolo appropriato. Salvare le impostazioni dell'esperimento corrente per recuperarle nelle esecuzioni future (facoltativo).

5. Analisi post-acquisizione

1. Se necessario, eseguire la messa a punto dei gate o dei marcatori di quadrante dopo l'acquisizione.
2. Individua l'esperimento che deve essere modificato navigando nel browser di file del sistema e aprilo.
3. Tocca l'anteprima in miniatura della trama per ingrandirla. Tocca gli angoli in alto a sinistra o in basso a destra del cancello della cella per regolare le dimensioni del cancello. Per regolare gli indicatori del quadrante, tocca l'intersezione delle linee verticali e orizzontali per spostare gli indicatori così come sono. Per regolare l'angolo di una delle due linee, tocca la linea e trascina la maniglia.
4. Regolare i marcatori (come descritto in precedenza nei passaggi 4.1.3-4.1.4) come desiderato e applicare queste impostazioni a tutti gli esempi dell'esperimento selezionando l'icona del segno di spunta , contrassegnando tutti gli esempi e selezionando Accetta.

6. Analisi statistica

1. Eseguire test in triplice copia ed eseguire un'analisi della varianza (ANOVA) con un test Bonferroni post-hoc per valutare le differenze significative tra i campioni trattati e i controlli.
   NOTA: Il test statistico di scelta dipende dallo sperimentatore e dalle variabili analizzate.

Results

I risultati del conteggio delle cellule e della vitalità (Figura 3) hanno mostrato che il 95,2% delle cellule del campione erano vive e il 4,8% erano morte. La concentrazione totale delle cellule nel campione originale era di 6,20 x 10⁶ cellule/ml.

Il test di Annexin V e di morte cellulare (Figura 4) ha mostrato un aumento significativo (p < 0,0001) nelle cellule apoptotiche nelle cellule SiHa trattate con 100 ng/mL actinomicina D rispetto ai controlli. Poiché la colorazione dell'annessina V è aumentata nelle cellule durante l'apoptosi in fase iniziale, questa scoperta suggerisce che 100 ng / mL actinomicina D hanno indotto l'apoptosi nelle cellule SiHa.

Il saggio del potenziale transmembrana elettrochimico mitocondriale (Figura 5) ha dimostrato una diminuzione significativa (p < 0,0001) nei profili di salute cellulare (vivo, depolarizzato e vivo, depolarizzato e morto, morto) tra actinomicina D, controllo del mezzo e controllo del solvente. Questi dati suggeriscono che 100 ng/mL di actinomicina D hanno indotto la depolarizzazione mitocondriale nelle cellule SiHa.

Il test della caspasi 3/7 (Figura 6) ha dimostrato un'attivazione significativa (p < 0,0001) delle caspasi 3 e 7 nelle cellule SiHa trattate con 100 ng/mL actinomicina D rispetto ai controlli. Questi risultati dimostrano che 100 ng / mL actinomicina D hanno indotto l'apoptosi nelle cellule SiHa.

Il test del danno al DNA (Figura 7) ha mostrato che 100 ng/mL di actinomicina D in modo significativo (p < 0,0001) hanno indotto marcatori di danno al DNA, ATM e H2A. X, nelle cellule di SiHa. Questa scoperta suggerisce un aumento significativo del danno al DNA nelle cellule SiHa trattate con actinomicina D.

I risultati degli esperimenti subottimali (Figura 8) dimostrano considerazioni analitiche in tutti i saggi. La concentrazione cellulare influisce sull'accuratezza dei dati. Nella Figura 8A, il numero di cellule è inaccettabilmente basso. Le popolazioni di cellule dipendenti in tutti e 4 i quadranti del dot plot hanno una bassa intensità del segnale. Il produttore ottimizza il test per 300-700 cellule/μL nel volume finale del campione. Questo esempio illustra l'importanza di utilizzare la corretta concentrazione del campione prescritta dal produttore.

Inoltre, alte concentrazioni cellulari hanno anche causato risultati errati (Figura 8B). Le colture medie e sperimentali hanno dimostrato rispettivamente il 99,95% e il 100% di cellule vive. La portata per entrambi i test ha superato la concentrazione ottimizzata del produttore di 100-500 cellule/μL e ha richiesto la diluizione con 1x tampone di dosaggio per evitare analisi imprecise.

L'aggregazione cellulare deve essere evitata durante la preparazione di colture sperimentali in quanto produce risultati falsi a causa dell'aumento degli indici di dimensione cellulare, come illustrato nel saggio di annessina V. La figura 8C mostra un duplice problema di alta concentrazione cellulare che supera le istruzioni del produttore e l'aggregazione delle cellule, come evidenziato dagli indici di dimensione delle cellule superiori a 4 nel controllo del mezzo SiHa. L'alta concentrazione cellulare è illustrata dal rivestimento di cellule che formano un piano rosso brillante di cellule in colture medie, dimostrando popolazioni cellulari apoptotiche discordantemente elevate.

La colorazione prolungata delle colture può provocare un legame non specifico delle proteine e risultati falsi, come dimostrato dal saggio dell'annessina V. La Figura 8D mostra risultati simili per colture medie e sperimentali a causa della colorazione prolungata.

La scarsa manipolazione del campione, la tripsinizzazione prolungata delle cellule aderenti, il pipettaggio vigoroso durante le fasi di lavaggio e le fasi di centrifugazione prolungate e ad alta velocità causano la lisi cellulare e elevate quantità di detriti cellulari. Nella Figura 8E, le colture analizzate dal test caspasi 3/7 dimostrano un aumento dei detriti cellulari evidenziato da un indice di dimensione delle piccole cellule (indice di dimensione delle cellule <2,2). Occorre pertanto prestare attenzione quando si preparano i campioni per l'acquisizione dei dati.

Figura 3: Conteggio delle cellule e saggio di vitalità. Il profilo della popolazione separa i detriti dalle cellule vive e morte. Il dot plot bidimensionale è recintato e divide popolazioni di cellule vive e morte. Il pannello informativo fornisce dati quantitativi sulla conta cellulare, la percentuale di cellule vitali totali e il numero totale di cellule vitali nel campione. Questi dati possono essere utilizzati per standardizzare il conteggio delle cellule in tutti i campioni per le successive analisi di apoptosi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Saggio dell'annessina V. Tutti i campioni mostrano parametri di gating identici e l'analisi statistica di ciascuna sottopopolazione rivela un aumento significativo dell'apoptosi nelle cellule trattate con actinomicina D. Tutti i test sono stati eseguiti come tre esperimenti indipendenti e ogni esperimento è stato analizzato in triplice copia. I dati sono presentati come media ± DS e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Saggio del potenziale transmembrana elettrochimico mitocondriale. Tutti i campioni mostrano parametri di gating identici e l'analisi statistica di ciascuna sottopopolazione rivela una perturbazione significativa del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule trattate con actinomicina D. Tutti i test sono stati eseguiti come tre esperimenti indipendenti e ogni esperimento è stato analizzato in triplice copia. I dati sono presentati come media ± DS e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Saggio di rilevamento della caspasi 3/7. Tutti i campioni mostrano parametri di gating identici e l'analisi statistica di ciascuna sottopopolazione rivela un aumento significativo dell'attività della caspasi 3/7 nelle cellule trattate con actinomicina D. Tutti i test sono stati eseguiti come tre esperimenti indipendenti e ogni esperimento è stato analizzato in triplice copia. I dati sono presentati come media ± DS e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Analisi del danno al DNA. Tutti i campioni mostrano parametri di gating identici e l'analisi statistica di ciascuna sottopopolazione rivela un aumento significativo del danno al DNA a doppio filamento e del danno totale al DNA nelle cellule trattate con actinomicina D. Tutti i test sono stati eseguiti su tre esperimenti indipendenti e ogni esperimento è stato analizzato in triplice copia. I dati sono presentati come media ± DS e p < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. * p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Condizioni sperimentali subottimali producono scarsi risultati . (A) Bassa concentrazione di cellule, (B) alta concentrazione di cellule, (C) aggregazione e aggregazione cellulare evidente da un elevato indice di dimensione cellulare, (D) colorazione prolungata dei campioni cellulari evidente da una maggiore colorazione positiva in entrambi i campioni e (E) scarsa manipolazione del campione evidente da un aumento dei detriti cellulari (indice di dimensione delle cellule < 2.2). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

In questo studio, le cellule SiHa trattate con actinomicina D analizzate da FC hanno rivelato significativi biomarcatori precoci e tardivi per l'apoptosi. Condizioni non ottimali per la preparazione, l'enumerazione e la colorazione delle celle hanno identificato risultati imprecisi, sottolineando la necessità di una stretta aderenza alle istruzioni del produttore durante l'esecuzione di FC.

Questo studio dell'apoptosi mediante identificazione precoce e tardiva di biomarcatori è conforme alle linee guida NCCD¹ per lo studio dell'apoptosi. Le colture di SiHa trattate con attinomicina D hanno dimostrato biomarcatori positivi per le fasi apoptotiche precoci e tardive. Il test Annexin V/PI e il test di permeabilità mitocondriale hanno mostrato che l'actinomicina D induceva rispettivamente un pattern PS-flip e una dissipazione della transizione della membrana mitocondriale. Una volta che le cellule apoptotiche raggiungono il punto di non ritorno indotto dalla perturbazione mitocondriale, le caspasi terminali si attivano ^3,7. L'attivazione delle caspasi terminali 3 e 7 osservata in questo studio indica apoptosi in stadio avanzato. Inoltre, l'attivazione della caspasi terminale causa la scissione internucleosomiale del DNA e un'estesa frammentazione del DNA, che classicamente è stata riportata come un pattern step-ladder osservato dall'elettroforesi su gel^28,38.

Il danno nucleare con l'ATM e H2A. Il test del danno al DNA di X FC ha mostrato rotture a doppio filamento nel DNA e danni totali al DNA. Questi risultati hanno confermato il classico danno nucleare apoptotico indotto da caspasi a valle (carorrexis e carorrlisi) in colture sperimentali. L'uso di biomarcatori citometrici a flusso multipli ha quindi rilevato gli eventi sequenziali multistadio nell'apoptosi e identificato in modo accurato e riproducibile le popolazioni cellulari nelle fasi apoptotiche iniziali e tardive. Questi risultati sono coerenti con le note caratteristiche pro-apoptotiche dell'actinomicina D nel trattamento del cancro nell'uomo 37,39,40,41 e supportano ulteriormente l'uso dell'actinomicina D come controllo positivo negli esperimenti di coltura cellulare FC che studiano l'apoptosi.

Il gating delle popolazioni cellulari in questo studio è stato informato da controlli negativi del mezzo e del solvente, che hanno separato le cellule apoptotiche da quelle sane. In alternativa, una miscela di popolazioni di controlli positivi e negativi può anche essere utilizzata per definire popolazioni cellulari vive e apoptotiche per impostare le porte della popolazione cellulare ^7,9. Una volta definiti e controllati gli stati cellulari malati e sani, le impostazioni del modello possono essere applicate a tutte le successive colture sperimentali e di controllo.

Il rigoroso rispetto del protocollo FC è essenziale per evitare risultati falsi. Durante l'ottimizzazione del protocollo, sono stati osservati i seguenti problemi: (1) bassa concentrazione cellulare, (2) alta concentrazione cellulare, (3) aggregazione cellulare, (4) colorazione prolungata e (5) scarsa gestione del campione. Questi problemi possono essere evitati rispettando rigorosamente i requisiti del protocollo ottimizzato. Ciò sottolinea la natura cruciale dei passaggi pre-analitici e analitici per FC per ottenere dati accurati. Durante la preparazione cellulare, la tripsinizzazione, il pipettaggio, la centrifugazione e le diluizioni devono essere condotti con cura. L'eccessiva tripsinizzazione e il pipettaggio vigoroso possono causare rispettivamente il taglio chimico e meccanico delle cellule. La centrifugazione prolungata e ad alta velocità può provocare la rottura delle cellule e un elevato numero di detriti cellulari. È necessaria una concentrazione cellulare ottimale per ridurre al minimo l'acquisizione errata degli eventi cellulari. Pertanto, le sospensioni cellulari primarie devono essere diluite per ottenere una concentrazione cellulare ottimale.

Inoltre, durante la manipolazione dei campioni, è necessario prestare attenzione per prevenire l'aggregazione cellulare e la frammentazione cellulare e garantire che le cellule rimangano in sospensione durante l'analisi. La manipolazione del campione per prevenire l'aggregazione delle cellule consente il flusso di singole celle laminari, previene il blocco meccanico dei tubi capillari dello strumento e riduce gli indici spuri di grandi dimensioni delle celle. Un altro avvertimento è proteggere le colture dalla luce per evitare la foto-ossidazione e la tempra dei fluorofori nei saggi per evitare risultati falsi negativi. È necessario prestare attenzione per garantire un'esposizione minima alla luce nella fase di colorazione delle cellule e nelle successive fasi di lavorazione. Inoltre, tempi di immunocolorazione prolungati possono portare a risultati falsi positivi poiché le proteine sono colorate in modo non specifico. Pertanto, è importante rispettare i periodi di colorazione di incubazione prescritti dal produttore.

In sintesi, FC può rilevare con precisione l'apoptosi e discriminare tra biomarcatori di apoptosi precoce e tardiva nella coltura cellulare. Inoltre, i progressi della tecnologia hanno portato alla produzione di citometri a flusso da banco per scienziati non esperti per studiare la salute delle cellule e le complesse vie di segnalazione intracellulare.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre a 6 pozzetti	Lasec	P1PLA044C-000006
Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D8418
DMEM	ThermoFisher	41966052
Glutammina	Sigma-Aldrich	P10-040500
Guava Muse Cell Analyzer	Luminex	0500-3115
Provette per microcentrifuga/Eppendorf	Kit Merck	EP0030122208-200EA
Muse Annexin V	Kit Merck	MCH100105
Muse Caspase-3/7	Kit Merck	MCH100108
Muse Conteggio e vitalità	Kit Merck	MCH600103
Muse Kit per danni al DNA	Merck	MCH200107
Muse Kit MitoPotential	Merck	MCH100110
PBS Tampone	ThermoFisher	70013065
Pen-strep	Sigma-Aldrich	P4333
Cellule SiHa	ATCC	CRL-1550
T25 fiasche di coltura	Sigma-Aldrich	C6231
Trypsin	Pan Biotech	P10-040500