单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成
Summary
单分子荧光能量转移是一种跟踪核糖体蛋白合成过程中tRNA动力学的方法。通过跟踪单个核糖体，确定不生菌种群，从而揭示机制。该方法可用于跟踪生物构象变化，以揭示许多其他复杂生物系统中的动态函数关系。单分子方法可以观察到非速率限制步骤和人口较少的关键中间体，由于平均效果，传统组合方法无法访问这些中间体。
Abstract
核糖体是一种大型核糖核蛋白复合物，沿着mRNA模板加工组装蛋白质。核糖体的直径约为 20 nm，可容纳 A、P 和 E 位点的大型 tRNA 基板。因此，核糖体动力学自然会迅速去相。单分子法可以分别检测每个核糖体并区分不生菌种群，这对于揭示多成分系统的复杂机制至关重要。我们报告了基于尼康Ti2倒置显微镜的smFRET方法的细节，以探测核糖体蛋白L27和tRNA之间的核糖体动力学。L27 被标记在其独特的 Cys 53 位置，并重组为核糖体，设计为缺乏 L27。tRNA 在其肘部区域标记。当 tRNA 在拉长周期内移动到核糖体内的不同位置（如转位前和转位后）时，FRET 效率和动力学表现出差异，这暗示了多个子聚合。这些子群无法通过合奏方法检测到。基于 TIRF 的 smFRET 显微镜基于手动或电动倒置显微镜，配备自制激光照明。核糖体样品通过超浓缩净化，装入自建的多通道样品细胞，然后通过消逝的激光场照明。反射激光点可用于实现完美对焦的反馈控制。荧光信号由电动滤塔分离，由两台数字 CMOS 摄像机收集。强度通过 NIS 元素软件检索。
Introduction
核糖体是一个 20 纳米大的核糖核蛋白复合物，由大型 （50S） 和小型 （30S） 子组组合而成。它沿着 mRNA 模板以过程和合作性地组装长肽。核糖体 30S 与 fMet-tRNAfMet和 mRNA 结合以启动蛋白质合成，然后 50S 连接以形成 70S 启动复合体。tRNA 将氨基酸带到 A 站点（氨基酸 – tRNA 结合部位）的核糖体，而拉长的肽链则保存在 P 站点（肽-tRNA 结合部位）。在迁移前复合物中，肽链通过添加一种氨基酸被转移到 A 站点的 tRNA。同时，P 站点 tRNA 已脱乙酰。然后，A-，P-tRNA 移动到 P-，E-站点，形成迁移后复合体，其中电子站点表示 tRNA 退出站点。在此状态下，肽-tRNA 会移回 P 位点。拉长周期继续在前和后构象之间，而核糖体在mRNA上转移，一次1个科顿。核糖体是高度协调的不同功能位点，使这个过程高效和准确，如子单元间棘轮2，tRNA杂交波动3，GTPase激活4，L1茎开闭5等。因此，核糖体会迅速去相，因为每个分子都按照自己的速度移动。传统方法只能推断出明显的平均参数，但低人口或短寿命物种将掩盖在平均效果6。单分子方法可以通过单独检测每个核糖体来打破这一限制，然后通过统计重建7识别不同的物种。已实施不同的标记站点来检测核糖体动力学，例如 tRNA-tRNA 8、EF-G-L119、L1-tRNA10等之间的相互作用。此外，通过分别标记大和小子单位，观察到子单元间棘轮动能学和与因子的协调。同时，smFRET方法在其他中央生物过程中具有广泛的应用，多色FRET方法正在兴起。
以前，一个新的核糖体FRET对被开发14，15。重组核糖蛋白L27已被表达，纯化，并标记，并重新纳入核糖体。这种蛋白质与tRNA在近距离相互作用，有助于稳定转移后复合物中的P位tRNA。当tRNA从A-移动到P位点时，这种蛋白质和tRNA之间的距离被缩短，这可以通过smFRET信号来区分。使用统计方法和突变体已经识别出多个核糖体亚群，在迁移前但不是迁移后复合物中自发交换这些种群表明，核糖体在移动mRNA之前更灵活，在解码16、17、18时更刚性。这些变化对核糖体功能至关重要。在这里，协议描述了核糖体/tRNA标签的细节，它们被纳入核糖体，smFRET样品制备，和数据采集/分析19。
Protocol
Representative Results
Discussion
斯姆弗雷特对背景信号很敏感。首先，有必要给样品室涂上0.05%的补间，然后与核糖体溶液同时添加，以阻止核糖体与表面的非特定结合。要从接受者 Cy5 排放中看到荧光，氧气清除剂鸡尾酒（脱氧、葡萄糖和特罗洛克斯溶液）至关重要。如果没有此解决方案，接受器通道中的漂白速度太快，无法获取有用的信息。核糖体实验的另一个关键步骤，具体来说，是玻璃表面的PEG涂层。核糖体活动对表面…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国国家卫生研究院（R01GM111452）和韦尔奇基金会（E-1721）的支持。
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
Riferimenti
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochimica. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochimica. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
