Étude de transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique de synthèse de protéines ribosomes

Summary

Le transfert d’énergie de fluorescence à molécule unique est une méthode qui suit la dynamique de l’ARNt pendant la synthèse des protéines ribosomiques. En suivant les ribosomes individuels, des populations inhomogènes sont identifiées, ce qui met en lumière les mécanismes. Cette méthode peut être utilisée pour suivre les changements conformationnels biologiques en général afin de révéler les relations dynamique-fonction dans de nombreux autres biosystèmes complexes. Les méthodes à molécule unique peuvent observer des pas de limitation de débit et des intermédiaires clés peu peuplés, qui ne sont pas accessibles par les méthodes d’ensemble conventionnelles en raison de l’effet moyen.

Abstract

Le ribosome est un grand complexe ribonucléoprotéique qui assemble les protéines de manière processive le long des modèles d’ARNm. Le diamètre du ribosome est d’environ 20 nm pour accueillir de grands substrats d’ARNt sur les sites A, P et E. Par conséquent, la dynamique des ribosomes est naturellement déphasée rapidement. La méthode à molécule unique peut détecter chaque ribosome séparément et distinguer les populations inhomogènes, ce qui est essentiel pour révéler les mécanismes complexes des systèmes à plusieurs composants. Nous rapportons les détails d’une méthode smFRET basée sur le microscope inversé Nikon Ti2 pour sonder la dynamique des ribosomes entre la protéine ribosomique L27 et les ARNt. Le L27 est étiqueté à sa position unique Cys 53 et reconstitué en un ribosome conçu pour manquer de L27. L’ARNt est marqué à la région du coude. Au fur et à mesure que l’ARNt se déplace vers différents endroits à l’intérieur du ribosome pendant le cycle d’allongement, tels que la pré- et la post-translocation, l’efficacité et la dynamique fret présentent des différences, qui ont suggéré de multiples sous-populations. Ces sous-populations ne sont pas détectables par les méthodes d’ensemble. Le microscope smFRET basé sur le TIRF est construit sur un microscope inversé manuel ou motorisé, avec un éclairage laser fait maison. Les échantillons de ribosomes sont purifiés par ultracentrifugation, chargés dans une cellule d’échantillonnage multicanal construite à la maison, puis éclairés via un champ laser évanescent. Le point laser à réflexion peut être utilisé pour obtenir un contrôle de rétroaction de la mise au point parfaite. Les signaux de fluorescence sont séparés par une tourelle filtrante motorisée et collectés par deux caméras CMOS numériques. Les intensités sont récupérées via le logiciel NIS-Elements.

Introduction

Le ribosome est un grand complexe ribonucléoprotéique de ø 20 nm d’une grande (50S) et d’une petite (30S) sous-unité. Il assemble de longs peptides le long du modèle d’ARNm de manière processive et coopérative. Le ribosome 30S se lie à l’ARNm^fMet et à l’ARNm pour commencer la synthèse des protéines, et le 50S se joint ensuite pour former le complexe d’initiation 70S. Les ARNt apportent des acides aminés au ribosome au site A (site de liaison de l’aRNt aminoacyle), tandis que la chaîne peptidyle allongée est maintenue au site P (site de liaison de l’ARNt peptidyle). Dans le complexe de pré-translocation, la chaîne peptidyle est transférée à l’ARNt au site A avec un acide aminé ajouté. Pendant ce temps, l’ARNt du site P est désacylé. Ensuite, les ARNt A, P se déplacent vers les sites P, E pour former le complexe post-translocation, dans lequel le site E représente le site de sortie de l’ARNt. Dans cet état, le peptidyl-ARNt retourne au site P. Le cycle d’allongement se poursuit entre les pré- et post-conformations tandis que le ribosome se transloque sur l’ARNm, un codon à la fois^1. Le ribosome est hautement coordinateur de différents sites fonctionnels pour rendre ce processus efficace et précis, tels que le cliquet inter-sous-unités^2,les fluctuations d’hybridation de l’ARNt^3,les activations de la GTPase^4,l’ouverture-fermeture de la tige L1^5,etc. Par conséquent, les ribosomes se déphasent rapidement car chaque molécule se déplace à son propre rythme. Les méthodes conventionnelles ne peuvent déduire que des paramètres moyens apparents, mais les espèces peu peuplées ou de courte durée de vie seront masquées dans l’effet moyen⁶. La méthode à molécule unique peut briser cette limitation en détectant chaque ribosome individuellement, puis identifier différentes espèces via une reconstruction statistique⁷. Différents sites de profilage ont été mis en œuvre pour sonder la dynamique des ribosomes, tels que les interactions entre l’ARNt-ARNt^8,l’EF-G-L11^9,l’ARNt^10,etc. De plus, en étiquetant les grandes et les petites sous-unités, respectivement, on observe une cinétique de cliquet inter-sous-unités et une coordination avec les facteurs^11,12. Pendant ce temps, la méthode smFRET a de vastes applications dans d’autres processus biologiques centraux, et les méthodes FRET multicolores émergent¹³.

Auparavant, une nouvelle paire fret de ribosomes a été développée^14,15. La protéine ribosomique recombinante L27 a été exprimée, purifiée et étiquetée, et réincorporée dans le ribosome. Cette protéine a interagi avec les ARNt à une distance rapprochée et a aidé à stabiliser l’ARNt du site P dans le complexe post-translocation. Lorsque l’ARNt se déplace du site A vers le site P, la distance entre cette protéine et l’ARNt est raccourcie, ce qui peut être distingué par le signal smFRET. De multiples sous-populations de ribosomes ont été identifiées à l’aide de méthodes statistiques et de mutagénèse, et l’échange spontané de ces populations dans le complexe pré- mais pas post-translocation suggère que le ribosome est plus flexible avant de se déplacer sur l’ARNm, et plus rigide lors du décodage^16,17,18. Ces variations sont essentielles à la fonction du ribosome. Ici, le protocole décrit les détails du labeling ribosome/ARNt, leur incorporation dans le ribosome, la préparation de l’échantillon smFRET et l’acquisition/analyse des données¹⁹.

Protocol

1. Préparation du ribosome et de l’ARNt marqués pour la détection FRET Isoler le ribosome sans L27 de la souche IW312 d’E. coli selon les protocoles standard20,21. Extraire le ribosome ordinaire de la souche MRE600 d’E. coli. Cloner le gène rpmA de L27 avec le marqueur His-terminal C en plasmide pET-21b (+), qui est transformé et exprimé dans les cellules BL21(DE3)pLysS15. Purifier la prot?…

Representative Results

Le smFRET avait le ribosome marqué à la position médiane du trafic d’ARNt, pour distinguer la translocation de l’ARNt du site A vers le site P (Figure 1)15. La distance entre le résidu de étiquetage L27 et l’ARNt du site A ou P est de 52 ou 61 Å, respectivement, ce qui correspond à une efficacité FRET de 0,47 et 0,65. Après la collecte de l’image, les intensités de fluorescence des canaux donneur et accepteur ont été récupérées et tracées en ac…

Discussion

SmFRET est sensible aux signaux d’arrière-plan. Tout d’abord, il est nécessaire de recouvrir la chambre d’échantillonnage d’une interpolation à 0,05%, puis d’être ajouté en même temps que la solution de ribosome pour bloquer la liaison non spécifique du ribosome à la surface. Pour voir la fluorescence de l’émission de cy5 de l’accepteur, le cocktail piégeur d’oxygène (solutions de désoxy, de glucose et de Trolox) est essentiel. Sans cette solution, le blanchiment est trop rapide dans le canal…

Materials

Aminosilane	Laysanbio	MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG	Laysanbio	Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells	Novagen	71403
Catalase	millipore sigma	C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge	nuaire
Cy3/C5-maleimide	ApexBio	A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope	Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood	Baker
Glucose oxidase	millipore sigma	G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column)	Cytiva	17524701
Microscope cover slip	VWR	48393-230
Microscope glass slides	VWR	470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera	Hamamatsu
PEG (5,000)	Laysanbio	MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid	Novagen	69741
Sonicator	VWR	CPX-952-518R
TCEP	Apexbio	B6055
Trolox	millipore sigma	238813