Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese
Summary
Enkeltmolekyl fluorescens energioverføring er en metode som sporer tRNA-dynamikken under ribosomal proteinsyntese. Ved å spore individuelle ribosomer identifiseres inhomogene populasjoner, som kaster lys over mekanismer. Denne metoden kan brukes til å spore biologiske konformasjonsendringer generelt for å avdekke dynamiske funksjonsrelasjoner i mange andre komplekse biosystemer. Enkeltmolekylmetoder kan observere ikke-rate begrensende trinn og lavfylte viktige mellomprodukter, som ikke er tilgjengelige ved konvensjonelle ensemblemetoder på grunn av den gjennomsnittlige effekten.
Abstract
Ribosomet er et stort ribonukleoproteinkompleks som samler proteiner prosessivt langs mRNA-maler. Diameteren på ribosomet er ca. 20 nm for å imøtekomme store tRNA-substrater på A-, P- og E-anleggene. Følgelig blir ribosomdynamikken naturlig avfaset raskt. Enkeltmolekylmetode kan oppdage hvert ribosom separat og skille inhomogene populasjoner, noe som er viktig for å avsløre de kompliserte mekanismene til flerkomponentsystemer. Vi rapporterer detaljene i en smFRET-metode basert på Nikon Ti2 invertert mikroskop for å sondere ribososomdynamikken mellom ribosomalproteinet L27 og tRNAer. L27 er merket i sin unike Cys 53-posisjon og rekonstituert til et ribosom som er konstruert for å mangle L27. TRNA er merket i albueområdet. Når tRNA beveger seg til forskjellige steder inne i ribosomet under forlengelsessyklusen, for eksempel pre- og posttranslokasjon, viser FRET-effektiviteten og dynamikken forskjeller, som har foreslått flere subpopulations. Disse subpopulasjonene kan ikke påvises ved hjelp av ensemblemetoder. Det TIRF-baserte smFRET-mikroskopet er bygget på et manuelt eller motorisert invertert mikroskop, med hjemmebygd laserbelysning. Ribosomets prøver renses ved ultracentrifugation, lastes inn i en hjemmebygd flerkanals prøvecelle og deretter belyses via et unnvikende laserfelt. Refleksjon laser spot kan brukes til å oppnå tilbakemelding kontroll av perfekt fokus. Fluorescenssignalene skilles av et motorisert filtertårn og samles inn av to digitale CMOS-kameraer. Intensitetene hentes via NIS-Elements-programvaren.
Introduction
Ribosomet er et ø 20 nm stort ribonukleoproteinkompleks av en stor (50S) og en liten (30S) underenhet. Den monterer lange peptider langs mRNA-malen prosessivt og samarbeidsvillig. Ribosomet 30S binder seg til fMet-tRNAfMet og mRNA for å starte proteinsyntese, og 50S blir deretter med for å danne 70S initieringskomplekset. TRNAene bringer aminosyrer til ribosomet på A-stedet (aminoacyl-tRNA bindingssted), mens det langstrakte peptidylkjeden holdes på P-stedet (peptidyl-tRNA bindingssted). I pretranslokasjonskomplekset overføres peptidylkjeden til tRNA på A-stedet med en aminosyre tilsatt. I mellomtiden er P-området tRNA deacylated. Deretter flytter A-, P- tRNAene til P-, E-områdene for å danne posttranslokasjonskomplekset, der E-området representerer tRNA-utgangsstedet. I denne tilstanden beveger peptidyl-tRNA seg tilbake til P-området. Forlengelsessyklusen fortsetter mellom pre- og postkonformasjonene mens ribosomet translokaliseres på mRNA, en kodon om gangen1. Ribosomet er svært koordinerende for forskjellige funksjonelle nettsteder for å gjøre denne prosessen effektiv og nøyaktig, for eksempel inter-subenhet ratcheting2, tRNA hybridiseringsvingninger 3, GTPase aktiveringer4,L1 stilk åpning-lukking5,etc. Følgelig avfaser ribosomer raskt fordi hvert molekyl beveger seg i sitt eget tempo. De konvensjonelle metodene kan bare utlede tilsynelatende gjennomsnittlige parametere, men lavbefolkede eller kortvarige arter vil bli maskert i gjennomsnittlig effekt6. Enkeltmolekylmetode kan bryte denne begrensningen ved å oppdage hvert ribosom individuelt, og deretter identifisere forskjellige arter via statistisk rekonstruksjon7. Ulike merkingssteder er implementert for å undersøke ribosomdynamikk, for eksempel interaksjonene mellom tRNA-tRNA8, EF-G-L119, L1-tRNA10, etc. I tillegg, ved å merke de store og små underenhetene, observeres henholdsvis inter-subenhet ratcheting kinetikk og koordinering med faktorer11,12. I mellomtiden har smFRET-metoden brede applikasjoner i andre sentrale biologiske prosesser, og flere farger FRET-metoder dukker opp13.
Tidligere ble et nytt ribosome FRET-par utviklet14,15. Det rekombinante ribosomale proteinet L27 har blitt uttrykt, renset og merket, og innlemmet tilbake i ribosomet. Dette proteinet interagerte med tRNAene på nært hold og bidro til å stabilisere P-området tRNA i posttranslokasjonskomplekset. Når tRNA flyttet fra A- til P-området, blir avstanden mellom dette proteinet og tRNA forkortet, noe som kan preges av smFRET-signalet. Flere ribosole subpopulasjoner har blitt identifisert ved hjelp av statistiske metoder og mutagenese, og spontan utveksling av disse populasjonene i pre- men ikke post-translokasjonskomplekset antyder at ribosomet er mer fleksibelt før du beveger deg på mRNA, og stivere under dekoding16,17,18. Disse variasjonene er avgjørende for ribosomefunksjonen. Her beskriver protokollen detaljene for ribosom/tRNA-merking, deres innlemmelse i ribosomet, smFRET prøvepreparering og datainnsamling/analyse19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET er følsom for bakgrunnssignaler. For det første er det nødvendig å belegge prøvekammeret med 0,05% tween og deretter tilsetts samtidig med ribosomet for å blokkere ikke-spesifikk binding av ribosomet til overflaten. For å se fluorescens fra akseptoren Cy5-utslipp, er oksygenfangercocktailen (deoksy-, glukose- og Trolox-løsninger) viktig. Uten denne løsningen er blekingen for rask i akseptorkanalen for å få nyttig informasjon. Et annet kritisk skritt for ribosomeksperimenter, spesielt, er PEG-belegget p?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes av US National Institutes of Health (R01GM111452) og Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
Riferimenti
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochimica. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochimica. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
