Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes
Summary
En molekyl fluorescens energiöverföring är en metod som spårar tRNA dynamiken under ribosomal proteinsyntes. Genom att spåra enskilda ribosomer identifieras inhomogena populationer, vilket belyser mekanismer. Denna metod kan användas för att spåra biologiska konformationsförändringar i allmänhet för att avslöja dynamiska funktionsrelationer i många andra komplexa biosystem. Metoder med en molekyl kan observera icke-hastighetsbegränsande steg och lågbefolkade nyckelmediärer, som inte är tillgängliga med konventionella ensemblemetoder på grund av den genomsnittliga effekten.
Abstract
Ribosomen är ett stort ribonukleoproteinkomplex som monterar proteiner processivt längs mRNA-mallar. Ribosomens diameter är cirka 20 nm för att rymma stora tRNA-substrat vid A-, P- och E-platserna. Följaktligen är ribosomdynamiken naturligt avfasad snabbt. Enmolekylsmetod kan detektera varje ribosom separat och skilja inhomogena populationer, vilket är viktigt för att avslöja de komplicerade mekanismerna i flerkomponentsystem. Vi rapporterar detaljerna i en smFRET metod baserat på Nikon Ti2 inverterade mikroskop för att undersöka ribosom dynamiken mellan ribosomal protein L27 och tRNAs. L27 är märkt på sin unika Cys 53-position och rekonstitueras till en ribosom som är konstruerad för att sakna L27. TRNA är märkt vid armbågsregionen. Som tRNAenflyttningar till olikt lägen insida ribosomen under förlängningen cyklar, liksom pre- och post-translocation, FRET-effektivitetsvinsterna och dynamiken ställer ut skillnader, som har föreslagit multipel subpopulations. Dessa delpopulationer kan inte upptäckas med ensemblemetoder. Det TIRF-baserade smFRET-mikroskopet är byggt på ett manuellt eller motoriserat inverterat mikroskop med hembyggd laserbelysning. Ribosomproverna renas genom ultracentrifugation, laddas i en hembyggd flerkanalig provcell och belyses sedan via ett evanescent laserfält. Reflektionslaserpunkten kan användas för att uppnå feedbackkontroll av perfekt fokus. Fluorescenssignalerna separeras av ett motoriserat filtertorn och samlas in av två digitala CMOS-kameror. Intensiteterna hämtas via NIS-Elements programvara.
Introduction
Ribosomen är ett ø 20 nm stort ribonukleoproteinkomplex med en stor (50S) och en liten (30S) underenhet. Den monterar långa peptider längs mRNA-mallen processivt och samarbetsvilligt. Ribosomen 30S binder till fMet-tRNAfMet och mRNA för att starta proteinsyntesen, och 50S förenar sig sedan för att bilda 70S-initieringskomplexet. TRNAs ger aminosyror till ribosomen vid A-platsen (aminoacyl-tRNA-bindningsställe), medan den långsträckta peptidylkedjan hålls på P-site (peptidyl-tRNA-bindningsställe). I pre-translocation komplexet överförs peptidyl kedjan till tRNA på A-platsen med en aminosyra tillsatt. Under tiden är P-site tRNA deacylated. Sedan flyttar A-, P-tRNAs till P-, E-platserna för att bilda post-translocation-komplexet, där E-platsen representerar tRNA-utgångsplatsen. I detta tillstånd flyttar peptidyl-tRNA tillbaka till P-platsen. Förlängningscykeln fortsätter mellan pre- och postkonformationerna medan ribosomen flyttar på mRNA, en kodon i taget1. Ribosomen är mycket koordinativ av olika funktionella platser för att göra denna process effektiv och exakt, såsom inter-subunit ratcheting2, tRNA hybridiseringsfluktuationer3, GTPaseaktiveringar 4, L1 stjälk öppning-stängning5,etc. Följaktligen avfasar ribosomer snabbt eftersom varje molekyl rör sig i sin egen takt. De konventionella metoderna kan bara härleda uppenbara genomsnittliga parametrar, men lågbefolkade eller kortlivade arter kommer att maskeras igenomsnittseffekten 6. Enmolekylmetod kan bryta denna begränsning genom att upptäcka varje ribosom individuellt och sedan identifiera olika arter via statistisk rekonstruktion7. Olika märkningsplatser har implementerats för att undersöka ribosomdynamik, såsom interaktioner mellan tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10,etc. Genom att märka de stora respektive små underenheterna observeras dessutom11,12. Samtidigt har smFRET-metoden breda tillämpningar i andra centrala biologiska processer, och flerfärgade FRET-metoder växer fram13.
Tidigare utvecklades ett nytt ribosom FRET-par14,15. Det rekombinanta ribosomala proteinet L27 har uttryckts, renats och märkts och införlivats tillbaka i ribosomen. Detta protein interagerade med tRNAs på nära avstånd och hjälpte till att stabilisera P-site tRNA i post-translocation komplexet. När tRNA flyttades från A- till P-platsen förkortas avståndet mellan detta protein och tRNA, vilket kan särskiljas av smFRET-signalen. Flera ribosom subpopulationer har identifierats med hjälp av statistiska metoder och mutagenes, och spontant utbyte av dessa populationer i pre- men inte post-translocation komplexet tyder ribosomen är mer flexibel innan man flyttar på mRNA, och mer stel under avkodning16,17,18. Dessa variationer är väsentliga för ribosomfunktionen. Här beskriver protokollet detaljerna i ribosom/tRNA-märkning, deras införlivande i ribosomen, smFRET-provberedningen och datainsamling/analys19.
Protocol
Representative Results
Discussion
SmFRET är känsligt för bakgrundssignaler. Först är det nödvändigt att täcka provkammaren med 0,05% interpolering och sedan tillsättas samtidigt med ribosomlösningen för att blockera icke-specifik bindning av ribosomen till ytan. För att se fluorescens från acceptorn Cy5-utsläpp är syrereningscocktailen (deoxy-, glukos- och Trolox-lösningar) viktig. Utan denna lösning är blekningen för snabb i acceptorkanalen för att få användbar information. Ett annat kritiskt steg för ribosomexperiment är specifi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av US National Institutes of Health (R01GM111452) och Welch Foundation (E-1721).
Materials
| Aminosilane | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| Biotin-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS cells | Novagen | 71403 | |
| Catalase | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX Micro Ultracentrifuge | nuaire | ||
| Cy3/C5-maleimide | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 inverted microscope | Nikon | ||
| EdgeGARD Laminar Flow Hood | Baker | ||
| Glucose oxidase | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP column (Prepacked sepharose column) | Cytiva | 17524701 | |
| Microscope cover slip | VWR | 48393-230 | |
| Microscope glass slides | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 camera | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) plasmid | Novagen | 69741 | |
| Sonicator | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| Trolox | millipore sigma | 238813 |
Riferimenti
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
- Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
- Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
- Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
- Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
- Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
- Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochimica. 46 (38), 10767-10775 (2007).
- Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
- Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
- Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
- Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
- Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin’s inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochimica. 49 (45), 9732-9738 (2010).
- Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
- Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
- Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
- Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
- Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
- Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
- Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
- Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
- Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
- Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
- Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
- Tsai, T., et al. High-Efficiency “-1” and “-2” Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
- Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
- Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
