2D و 3D المستحثة من قبل الإنسان نماذج الخلايا الجذعية متعددة القدرات القائمة على تشريح تورط سيليوم الأولية أثناء تطور القشرة المخية الجديدة
Summary
نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف 2D و 3D المستحثة بالإنسان الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hIPSC) القائمة على تطوير القشرة المخية الحديثة بالإضافة إلى منهجيات تكميلية تمكن من التحليل النوعي والكمي للنشأة الحيوية الأولية (PC) ووظيفتها.
Abstract
الأهداب الأولية (PC) هي عضيات ديناميكية غير متحركة قائمة على الأنابيب الدقيقة تبرز من سطح معظم خلايا الثدييات. وهي تخرج من المريكز الأقدم خلال مرحلة G1 / G0 من دورة الخلية ، بينما تتفكك مع عودة الخلايا إلى دورة الخلية عند حدود مرحلة G2 / M. وهي تعمل كمحاور إشارة ، من خلال اكتشاف ونقل الإشارات خارج الخلية الحاسمة للعديد من عمليات الخلايا. على غرار معظم أنواع الخلايا ، فقد ثبت أن جميع الخلايا الجذعية والسلفية العصبية القشرية الجديدة (NSPCs) تؤوي جهاز كمبيوتر يسمح لها باستشعار ونقل إشارات محددة مطلوبة للنمو القشري الدماغي الطبيعي. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لإنشاء وتوصيف النماذج القائمة على الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hIPSCs) لزيادة تشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي أثناء تطوير القشرة المخية الجديدة. على وجه الخصوص ، نقدم بروتوكولات لدراسة التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته في NSPCs المشتقة من الوردة العصبية 2D بما في ذلك نقل مسار القنفذ الصوتي (SHH). للاستفادة من التنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) للعضويات الدماغية ، نصف طريقة بسيطة للتصوير ثلاثي الأبعاد للعضويات الدماغية الملطخة بالمناعة. بعد التطهير البصري ، يسمح الاكتساب السريع للعضويات بأكملها بالكشف عن كل من الجسيمات المركزية والكمبيوتر الشخصي على أسلاف القشرة المخية الجديدة والخلايا العصبية للعضوي بأكمله. أخيرا ، نقوم بتفصيل الإجراء الخاص بالتلطيخ المناعي وتطهير الأقسام العضوية السميكة العائمة بحرية مع الحفاظ على درجة كبيرة من المعلومات المكانية 3D والسماح بالحصول على دقة عالية المطلوبة للتحليل النوعي والكمي المفصل للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته.
Introduction
الأهداب الأولية (PC) هي عضيات تعتمد على الأنابيب الدقيقة التي تستشعر وتنقل عددا كبيرا من الإشارات الكيميائية والميكانيكية من البيئة خارج الخلية. على وجه الخصوص ، الكمبيوتر الشخصي هو العضية المركزية لنقل مسار إشارات القنفذ في الفقاريات1,2. في حين أن معظم الخلايا العصبية قد ثبت منذ فترة طويلة أنها تؤوي جهاز كمبيوتر ، إلا أن مساهمة هذه العضية في تشكيل الجهاز العصبي المركزي قد تم التقليل من قيمتها منذ فترة طويلة. أدت الدراسات التي أجريت على تطور القشرة المخية الجديدة إلى اكتشاف العديد من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPCs) ، وكلها تؤوي جهاز كمبيوتر ، وقد اقترح أن يكون موقعه حاسما لتحديد مصير السلف 3،4،5،6،7. وقد ثبت أن الكمبيوتر الشخصي ضروري لآليات الخلايا المطلوبة للنمو القشري الدماغي الطبيعي ، بما في ذلك توسيع NSPC والالتزام 8،9،10،11،12 وكذلك القطبية القاعدية للسقالة الدبقية الشعاعية التي تدعم الهجرة العصبية13. بالإضافة إلى ذلك ، مطلوب جهاز كمبيوتر أثناء الهجرة العرضية بين الخلايا العصبية إلى اللوحة القشرية 14,15. أخيرا ، تم اقتراح دور للكمبيوتر الشخصي في إنشاء اتصالات متشابكة للخلايا العصبية في القشرة الدماغية16,17. وإجمالا، تجادل هذه النتائج بدور حاسم للكمبيوتر الشخصي في الخطوات الرئيسية للتطور القشري الدماغي18،19 وتثير الحاجة إلى التحقيق في تورطها في الآليات المرضية الكامنة وراء الشذوذ في التطور القشري الدماغي.
وقد حسنت الدراسات الحديثة إلى حد كبير فهمنا للاختلافات الخلوية والجزيئية الهامة بين التطور القشري في النماذج البشرية والحيوانية، مع التأكيد على الحاجة إلى تطوير أنظمة النماذج البشرية. في هذا الرأي، تمثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hIPSCs) نهجا واعدا لدراسة التسبب في الأمراض في سياق جيني وخليوي ذي صلة. تحتوي النماذج الخلوية ثنائية الأبعاد (2D) الملتصقة أو الورود العصبية على NSPCs مماثلة لتلك التي شوهدت في القشرة الدماغية النامية ، والتي تصبح منظمة في هياكل على شكل وردة تظهر قطبية أبيكوبازية صحيحة20،21،22. علاوة على ذلك ، يسمح نظام الاستزراع ثلاثي الأبعاد (3D) بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية التي تلخص العديد من ميزات التطور القشري الدماغي البشري23،24،25،26. يقدم هذان النهجان التكميليان للنمذجة القائمة على الخلايا وجهات نظر مثيرة لتشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي أثناء التطور الطبيعي والمرضي للقشرة الدماغية.
هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف الورود العصبية و NSPCs المشتقة وكذلك الأعضاء الظهرية في الدماغ الأمامي. كما نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل التكوين الحيوي ووظيفة الكمبيوتر الموجود على NSPCs من خلال اختبار نقل مسار القنفذ الصوتي وتحليل ديناميكيات الجزيئات الحاسمة المشاركة في هذا المسار. للاستفادة من تنظيم 3D من المواد العضوية الدماغية، ونحن أيضا إعداد طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتصوير 3D من في toto المناعية العضوية الدماغية مما يسمح اكتساب سريع، بفضل المجهر ورقة ضوء، من العضوية بأكملها، مع دقة عالية تمكن من تصور جهاز الكمبيوتر على جميع أنواع السلف القشرية الجديدة والخلايا العصبية من العضوية بأكملها. وأخيرا، قمنا بتكييف الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام 150 ميكرومتر العائمة الحرة مع التطهير والاقتناء اللاحق باستخدام المجهر البؤري الضوئي الرنين مما يسمح بالحصول على صورة عالية الدقة، وهو أمر مطلوب للتحليل التفصيلي للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته. على وجه التحديد ، يسمح برنامج التصوير ثلاثي الأبعاد بإعادة بناء الكمبيوتر الشخصي 3D مع التحليل اللاحق للمعلمات المورفولوجية بما في ذلك طول الكمبيوتر وعدده واتجاهه بالإضافة إلى قياس كثافة الإشارة للمكونات الهدبية على طول axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتبر الكمبيوتر الشخصي الآن عضيات رئيسية تنظم الخطوات الحاسمة أثناء التطور القشري الدماغي الطبيعي18،19،31 بما في ذلك توسيع NSPC والالتزام 8،9،10،11،12 وكذلك الهجرة العصبية13،14 وتكوين التشابك <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من الوكالة الوطنية للبحوث (ANR) إلى S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) و N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 و ANR-19-CE16-0002-01). يتم دعم LB من قبل ANR في إطار برنامج Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) ومؤسسة Bettencourt Schueller (برنامج MD-PhD). يتم دعم معهد Imagine بتمويل حكومي من ANR في إطار برنامج Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01 ، مشاريع CrossLab) وكجزء من برنامج Investissements d’Avenir الثاني (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
Riferimenti
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
- Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Biologia dello sviluppo. 370 (1), 33-41 (2012).
- Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
- Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
- Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
- Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
- Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
- Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
- Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
- Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
- Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
- Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
- Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
- Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
- Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
- Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
- Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
- Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
- Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
- Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2′-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).
